直鏈烷基苯磺酸鈉暴露對雄性小鼠的生殖毒性

王琦　劉小強　李丹　任春娥　劉維琴

[摘要] 目的 探討直鏈烷基苯磺酸鈉（LAS）對小鼠睪丸的損傷作用及其可能的機制。方法 將24只3周齡ICR種雄性小鼠隨機分為對照組和低、中、高劑量LAS染毒組（每組6只小鼠），4組分別給予生理鹽水、LAS 210 mg/kg、LAS 420 mg/kg和LAS 630 mg/kg連續(xù)灌胃30 d，每天1次。處死小鼠，收集血清，放射免疫法測定血清中睪酮濃度;分離睪丸和附睪組織，計數(shù)精子密度，光鏡觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)變化，實時熒光定量PCR檢測睪丸組織中甾體激素合成限速酶基因Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd3b2 mRNA的表達。結(jié)果 LAS染毒各劑量組小鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)、精子密度均較對照組降低（F=77.619～375.293，P<0.05）。光鏡觀察顯示，與對照組比較，LAS染毒高劑量組睪丸組織生精小管內(nèi)生精細胞排列稀疏，細胞層數(shù)減少，精原細胞壞死凝集，間質(zhì)細胞皺縮，支持細胞數(shù)量明顯減少。LAS染毒中、高劑量組睪酮濃度較對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.574，P<0.05）。LAS染毒各劑量組睪酮合成相關(guān)限速酶基因Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b2 mRNA表達水平均較對照組下降，并且與LAS劑量正相關(guān)，差異有顯著性（F=5.578～15.796，P<0.05）。結(jié)論 LAS能夠損害小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)，造成生精功能下降;并通過抑制Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b2等甾體激素合成限速酶基因的表達，減少睪酮的合成。

[關(guān)鍵詞] 直鏈烷基苯磺酸鈉;睪丸;睪酮;甾體激素合成限速酶基因

[中圖分類號] R339.2 ?[文獻標(biāo)志碼] A &nbsp;[文章編號] ?2096-5532（2019）04-0437-05

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of linear alkylbenzene sulfonate （LAS） in testicular injury in mice and its possible mechanisms. ?Methods Twenty-four 3-week-old male ICR mice were randomly divided into control group and low-， medium-， and high-LAS dose groups （6 mice in each group）. Four groups were given saline， LAS 210 mg/kg， LAS 420 mg/kg， and LAS 630 mg/kg， respectively， for 30 d， once a day. The mice were sacrificed and serum samples were collected. The testoste-rone concentration in serum was determined by radioimmunoassay; the testis and epididymis tissues were isolated， and the sperm density was determined. The morphology of the testis was observed by light microscopy， and the mRNA expression of steroid hormone synthesis rate-limiting enzyme genes including Star， Cyp11a1， Cyp17a1， and Hsd3b2 in the testis tissue was detected by quantitative real-time PCR. ?Results The organ coefficients of testis and epididymis and sperm density were lower in the LAS exposure groups than in the control group （F=77.619-375.293，P<0.05）. Light microscopy showed that compared with the control group， the high-LAS dose group had sparsely arranged spermatogenic cells in the seminiferous tubules， a reduced number of cell layers， necrotic and aggregated spermatogonia， shrunken interstitial cells， and a significantly reduced number of Sertoli cells. The medium-and high-LAS dose groups showed a significant reduction in testosterone concentration compared with the control group （F=25.574，P<0.05）. The mRNA expression levels Star， Cyp11a1， Cyp17a1， and Hsd3b2 were down-regulated in the me-dium- and high-LAS dose groups than in the control group， and were positively correlated with LAS dose （F=5.578-15.796，P<0.05）. Conclusion LAS can damage the morphological structure of the testis and impair the spermatogenic function of mice， and it can reduce the synthesis of testosterone by inhibiting the expression of steroid hormone synthesis rate-limiting enzyme genes such as Star， Cyp11a1， Cyp17a1， and Hsd3b2.

[KEY WORDS] linearalkylbenzenesulfonate; testis; testosterone; steroidogenic enzymes

隨著工業(yè)化和城市化建設(shè)速度的加快，環(huán)境因素對生殖健康的影響日趨嚴(yán)重[1]。環(huán)境污染可損傷生殖細胞染色體，引起胚胎源性疾病，對子代的生殖毒性包括子代生長發(fā)育緩慢、發(fā)育畸形、器官功能不全、胚胎停育、流產(chǎn)等[2]。表面活性劑是一種人工合成的化學(xué)洗滌劑，因其具有易溶于水并且去污力強特性而廣泛應(yīng)用于人類的生產(chǎn)和日常生活中。直鏈烷基苯磺酸鈉（LAS）是化學(xué)洗滌劑最主要的有效成分[3]。LAS幾乎在所有的環(huán)境介質(zhì)中都能檢測到。LAS可通過與人體皮膚直接接觸、餐具和蔬菜水果殘留等消化道方式進入人體，劑量通常非常小，一般認(rèn)為不會產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)。但是由于LAS成分中含有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的劇毒物苯，其含量雖低，卻很難降解和消除，導(dǎo)致LAS長久而持續(xù)地污染環(huán)境，因此LAS長期蓄積產(chǎn)生的毒性已經(jīng)引起人們廣泛關(guān)注。目前，對LAS生殖毒性的研究多集中于水生生物[4-6]，對哺乳動物生殖毒性的研究較少且多集中在形態(tài)學(xué)方面[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LAS口飼染毒可以影響雌性小鼠卵巢類固醇激素合成[8]。本研究研究LAS對小鼠睪丸形態(tài)、睪酮合成以及相關(guān)限速酶基因的影響，探討LAS對雄性小鼠的生殖毒性及其機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級3周齡健康ICR種雄性小鼠24只，體質(zhì)量8～11 g，由南京大學(xué)模式動物所提供。LAS（天津市鼎盛鑫化工有限公司，CAS：25155-30-0），DMEM 高糖培養(yǎng)液（HyClone），Premix Taq Version 2.0（TaKaRa），I125睪酮放免分析試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所），StepOne Plus Real-Time PCR儀（Applied Biosystems）。

1.2 動物分組與處理

將小鼠隨機分為對照組和低、中、高劑量LAS染毒組，每組6只。4組分別灌胃給予0、210、420、630 mg/kg LAS溶液（溶劑為生理鹽水），連續(xù)灌胃30 d，每天1次。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 臟器系數(shù)及精子密度測定 于末次染毒次日，戊巴比妥麻醉后稱小鼠體質(zhì)量，腹主動脈采血后處死。分離睪丸和附睪，分別稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=（臟器濕質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%）。剝?nèi)∫粋?cè)附睪，置于有1 mL生理鹽水的平皿中，用眼科剪縱行剪開并輕壓，靜置5 min后，用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)精子密度。將一側(cè)睪丸用40 g/L多聚甲醛固定，另一側(cè)睪丸于液氮中速凍冷藏。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 取多聚甲醛固定的睪丸組織，經(jīng)洗滌、脫水、組織透明、石蠟包埋、切片、HE染色、脫水、透明、樹脂封片等處理后，顯微鏡下觀察睪丸的組織形態(tài)，拍照并存檔。

1.3.3 睪酮濃度測定 將小鼠血液標(biāo)本以3 500 r/min離心10 min，分離上層血清，應(yīng)用I125睪酮放免分析試劑盒測定睪酮濃度。

1.3.4 Real-Time PCR檢測甾體激素合成限速酶Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd3b2基因的表達取液氮中冷藏睪丸，用Trizol法提取睪丸組織總RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-Time PCR按照試劑盒說明書進行，起始孵育溫度為95 ℃，時間為60 s;變性溫度為95 ℃，時間為15 s;退火溫度為60 ℃，時間為60 s;延伸溫度72 ℃，時間為180 s。擴增循環(huán)40個周期。內(nèi)參為GAPDH，各引物序列見表1。結(jié)果用2-ΔΔCt表示[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以±s形式表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化和睪丸、附睪臟器系數(shù)及精子密度比較

實驗過程中，各組小鼠均生長正常，體質(zhì)量增加量差異無顯著性（P>0.05）。LAS染毒低、中、高劑量組小鼠的睪丸及附睪臟器系數(shù)均低于對照組，精子密度低于對照組，并且以上指標(biāo)隨著LAS染毒劑量增加逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=77.619～375.293，P<0.05）。見表2。

2.2 各組睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較

HE染色顯示，對照組睪丸生精小管的基膜、生精上皮結(jié)構(gòu)完整，細胞排列規(guī)則有序，精原細胞分布緊靠基膜，生精細胞與支持細胞連接緊密，間質(zhì)細胞飽滿，形態(tài)正常。LAS染毒低劑量組與對照組比較睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯差異;中劑量組生精小管結(jié)構(gòu)大多數(shù)尚完整，基膜細胞稀疏，部分區(qū)域排列紊亂;高劑量組生精小管內(nèi)生精細胞排列稀疏，細胞層數(shù)減少，精原細胞壞死凝集，間質(zhì)細胞皺縮，支持細胞數(shù)量明顯減少。

2.3 各組睪酮濃度比較

與對照組比較，LAS染毒中、高劑量組睪酮濃度均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.574，P<0.05），低劑量組與對照組比較睪酮濃度差異無顯著性（P>0.05）。見表2。

2.4 各組睪丸組織中甾體激素合成基因表達比較

與對照組相比較，LAS染毒各劑量組甾體激素合成基因Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd3b2的mRNA的表達水平均下降;并且隨著LAS劑量的增加，Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd3b2 mRNA的表達均呈明顯下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.578～15.796，P<0.05）。見表3。

3 討 ?論

生殖器官最容易受環(huán)境污染物的影響，尤其胚胎期和青春期，環(huán)境污染物在生殖器官發(fā)育過程中的干擾作用更明顯[10]。環(huán)境污染物可影響生殖細胞功能，導(dǎo)致體內(nèi)內(nèi)分泌異常，影響生殖系統(tǒng)激素合成分泌，影響生殖功能[11-13]。因此，研究環(huán)境對內(nèi)分泌干擾時，暴露期的選擇十分重要。本實驗以3周齡青春期小鼠睪丸為研究對象，通過睪丸整體體外培養(yǎng)途徑，盡可能保持了細胞之間的聯(lián)系與器官的整體性，為從分子機制方面初步探討LAS對小鼠睪丸睪酮合成影響的理想模型。研究顯示，人體普遍暴露在LAS中，量雖較小，但長期蓄積可能對人體造成一定影響[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，每日經(jīng)皮膚直接接觸、餐具和蔬菜水果殘留等方式進入體內(nèi)LAS量可達10 mg以上[16-17]，因此本研究設(shè)立3個不同濃度LAS染毒組，所設(shè)劑量范圍涵蓋了人體暴露劑量。

精原細胞脫落、間質(zhì)細胞皺縮是睪丸損傷后常見而明顯的形態(tài)學(xué)改變[18]。本文研究結(jié)果顯示，與對照組比較，LAS染毒中劑量組的小鼠睪丸組織中精原細胞壞死凝集、間質(zhì)細胞皺縮，曲細精管內(nèi)生精細胞排列稀疏，細胞層數(shù)減少，精原細胞壞死凝集，間質(zhì)細胞皺縮，支持細胞數(shù)量明顯減少，且此變化與染毒濃度呈正相關(guān)。韓海艷等[7]和張穎等[19]的研究顯示，LAS可導(dǎo)致精子形態(tài)發(fā)生改變，畸形率上升。還有對雄性生殖毒性研究結(jié)果顯示，環(huán)境污染物雙酚A可以使小鼠睪丸中精原細胞脫落消失，間質(zhì)細胞皺縮[20]。本研究中LAS對睪丸細胞的形態(tài)學(xué)影響結(jié)果與以上文獻結(jié)果相似。

睪丸間質(zhì)細胞是雄性體內(nèi)合成睪酮的主要部位。本研究發(fā)現(xiàn)，LAS染毒各劑量組小鼠睪丸間質(zhì)細胞分泌的睪酮濃度下降，隨著染毒劑量的增加，睪酮濃度下降更加明顯，說明LAS暴露的生殖毒性具有劑量效應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)，睪酮可以促進睪丸曲細精管的發(fā)育和精子發(fā)生和成熟，睪酮的降低可以影響生精小管的發(fā)育[21]。本研究中，LAS可引起曲細精管的損傷性改變，并可影響睪酮的合成，這一惡性循環(huán)最終導(dǎo)致了雄性小鼠生育功能的受損。

甾體激素合成限速酶包括Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd3b2等在睪酮合成的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[22-23]。Star將體內(nèi)的游離膽固醇轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Cyp11a1可催化轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜的膽固醇為孕烯醇酮，孕烯醇酮又可在Cyp17a1的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樾巯┒?βHSD催化雄烯二酮轉(zhuǎn)變?yōu)椴G酮，繼而完成睪酮的分泌[24-25]。本研究中，隨著LAS劑量的增加，Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd3b2 mRNA的表達均呈明顯下降趨勢，說明LAS暴露能夠降低甾體激素合成限速酶基因的表達水平，在睪酮合成通路中下調(diào)相關(guān)甾體激素合成限速酶的表達可影響睪酮的合成，這可能是LAS產(chǎn)生生殖毒性的一個調(diào)節(jié)機制。

睪丸支持細胞是與精子發(fā)生密切相關(guān)的重要細胞，為各級生精細胞提供營養(yǎng)支持及合適的生精微環(huán)境，并參與血-睪屏障的組成。睪丸組織中支持細胞與間質(zhì)細胞緊密相鄰，為睪酮的合成分泌提供結(jié)構(gòu)支持和旁分泌調(diào)節(jié)。支持細胞通過分泌抑制素B等物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)血清睪酮的合成[26]。LAS染毒高劑量組支持細胞裂解和減少，提示LAS可能對睪丸支持細胞骨架有影響。這可能是睪酮合成在LAS高劑量組明顯下降，導(dǎo)致睪丸發(fā)育障礙的原因之一。

此外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，LAS可損傷人張氏肝細胞和皮膚細胞，其機制可能通過引起相應(yīng)組織的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化應(yīng)激通路障礙，產(chǎn)生對各組織的損傷作用[27]。在應(yīng)用抗氧化物質(zhì)后，小鼠皮膚內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)功能增強，改善了LAS的損傷作用[28]。本課題組前期的研究結(jié)果顯示，對雌性小鼠進行LAS口飼染毒后，其雌性子代血清類固醇激素水平、血清SOD活力以及卵巢Star和P450scc的mRNA相對表達量均降低，血清MDA水平則升高，且呈線性相關(guān)[8]。這說明氧化應(yīng)激損傷也可能是類固醇激素合成障礙的機制之一。

綜上所述，LAS可以影響青春期小鼠睪丸的形態(tài)及功能，減少睪酮的合成，這種改變與染毒劑量呈正相關(guān)。在中劑量LAS染毒時，可能通過下調(diào)睪酮合成過程中的甾體激素合成基因包括Cyp17a1、Cyp11a1、Star和Hsd3b2等的表達，降低睪酮的合成;在高劑量LAS染毒時，睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，睪酮合成相關(guān)酶的表達受抑制。綜合效應(yīng)的作用可能共同導(dǎo)致雄性小鼠生殖功能的損傷，影響了睪酮的合成。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）