BUB1B在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

周巖 母漢友 王淑芬 汪瑞忠

【關(guān)鍵詞】 原發(fā)性肝癌;細(xì)胞增殖;細(xì)胞侵襲;BUB1B

Clinical significance of BUB1B in hepatocellular carcinomaand its effect on proliferation and invasion of hepatoma cells Zhou Yan， Mu Hanyou，Wang Shufen， Wang Ruizhong. Department of Clinical Laborat-ory， Pudong New Area Peoples’ Hospital， Shanghai 201299， China

Corresponding author， Wang Ruizhong， E-mail： wrzhd@ qq. com

【Abstract】 Objective ?To investigate the expression and clinical significance of BUB1B in patients with hepatocellular carcinomaand（HCC）， and to evaluate its effect on the proliferation and invasion of human liver cancer cells in vitro. ?Methods The clinical data and the information of gene expression were collected from GEO database （GSE121248）. The differentially-expressing genes were screened and analyzed via bioinformatics analysis. A small interfering RNA vector was designed targeting BUB1B. The effect of BUB1B gene on the proliferation and invasion of liver cancer cells was assessed by silencing the expression of BUB1B gene. The knockdown efficiency was detected by quantitative real-time PCR. The proliferating and invasion abilities were evaluated by cell proliferation assay and wound healing test. The effect of the expression levels of BUB1B gene upon the clinical prognosis of HCC patients was assessed by KM-plotter database. ?Results The silence sequences 1 and 2 could significantly silence the expression of BUB1B mRNA （t=8.41， P=0.001; t=10.43， P < 0.001）. The proliferating ability of hepatoma cell line HepG2， which knocked down the expression of BUB1B gene， was significantly weakened （t=13.94， P < 0.001）. The invasion ability was also reduced at 8 h after knocking down the expression of BUB1B gene （t=14.94， P < 0.001）. The survival rate of HCC patients with high expression of BUB1B gene （n=127） was significantly lower than that of their counterparts with low expression of BUB1B gene （n = 237） [HR = 2.01 （1.42 ～ 2.86）， P = 6.6×10-5]. Further analysis found that the expression of BUB1B gene exerted no effect on the clinical prognosis of HCC patients with a medical history of hepatitis （n = 150） [HR = 1.88 （0.89 ～ 3.99）， P=0.093]， whereas it acted as a molecular biomarker to predict the clinical prognosis of HCC patients without a medical history of hepatitis （n = 167） [HR = 2.84 （1.75 ～ 4.61）， P = 1.1×10-5]. ?Conclusions The BUB1B gene is highly expressed in HCC patients， which can promote the proliferation and invasion of liver cancer cells. BUB1B gene is a potential molecular biomarker for predicting the clinical prognosis of HCC patients with no medical history of hepatitis.

【Key words】 Hepatocellular carcinomaand;Proliferation;Invasion;BUB1B

原發(fā)性肝癌（HCC）目前在全球癌癥相關(guān)死亡率中居第二位，且HCC在全球的發(fā)病率仍在上升，將很快超過100萬/年的發(fā)病率[1-2]。HCC同樣是我國常見的惡性腫瘤之一，患者主要集中在40 ～ 50歲，隨著肝癌腫瘤標(biāo)志物在HCC早期診斷中的應(yīng)用，其早期治療的總體療效明顯改善，但是病因和發(fā)病機(jī)制尚未確定[3-4]。研究HCC發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制以及尋找預(yù)測肝癌患者預(yù)后的標(biāo)志物是臨床診治工作中面臨的重要問題。最近研究表明紡錘體檢測蛋白BUB1B（又名BUBR1）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在重要意義，該蛋白是有絲分裂過程中重要的功能蛋白，在多種癌癥發(fā)生中具有重要作用，但是在肝癌中的作用研究較少[5-8]。該研究主要從GEO數(shù)據(jù)庫出發(fā)，篩選出HCC中高表達(dá)的差異表達(dá)基因BUB1B，通過小干擾RNA的方法沉默該基因表達(dá)，研究BUB1B基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、侵襲以及對(duì)HCC患者預(yù)后的影響。

對(duì)象與方法

一、臨床資料的獲取與差異基因篩選

選擇NCBI網(wǎng)站的Gene Expression Omnibus（GEO） 數(shù)據(jù)庫，在NCBI主頁的搜索下拉菜單中選擇GEO DataSets，搜索hepatocellular carcinomaand關(guān)鍵詞，在左邊項(xiàng)目欄中依次選擇Series、Expression profiling by array和tissue，在右邊Top Organisms中選擇Homo sapiens，在檢索的目錄中選

擇GSE121248數(shù)據(jù)集[9]。該數(shù)據(jù)集顯示了107例HCC患者的臨床信息以及基因表達(dá)信息，包括70例HCC組織和37例癌旁組織。下載得到該芯片的原始數(shù)據(jù)CEL格式文件以及臨床信息表格Series Matrix Files， 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Agilent 公司的軟件Gene SpringGX，分析得到差異表達(dá)基因。

二、生存分析

生存分析中的HCC患者來自KM-plotter數(shù)據(jù)庫，包括364例HCC患者，具體臨床信息包含是否有肝炎病毒感染史等信息[10]。通過選擇對(duì)應(yīng)的篩選條件獲得生存曲線。

三、實(shí)驗(yàn)儀器及材料

實(shí)驗(yàn)儀器：美國Applied Biosystems公司7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司的冷卻離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司的恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺(tái)。Nikon公司細(xì)胞倒置顯微鏡。

實(shí)驗(yàn)材料：天根公司的RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Biotool公司的SYBR Green熒光染料real-time PCR試劑盒，胎牛血清FBS和DMEM高糖培養(yǎng)基購買自Hyclone公司，雙抗（青霉素+鏈霉素）購買自Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購買自美國Thermo Scientific公司，siRNA-BUB1B購買自拓然生物。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d將HepG2細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染時(shí)密度約70%，在250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中加入5 μl siRNA-BUB1B混勻，在250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中加入5 μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混勻，靜置5 min后，將siRNA混合液滴入轉(zhuǎn)染試劑混合液中，靜置20 min，滴入細(xì)胞上清中，4 ～ 6 h后換含有FBS的DMEM培養(yǎng)基，48 h后檢測沉默效率。（沉默序列1：CGGAAGAAGATCTAGATGT，沉默序列2：AGCAGAGTTGTCTAAGCCT）。

2. 熒光定量PCR

用天根RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞RNA，將抽提的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Biotool公司的SYBR Green試劑盒檢測BUB1B基因的mRNA表達(dá)水平。BUB1B上游引物：5’- CTCGTGGCAATACAGCTYCA-3’，下游引物：5’- CTGGTCAATAGCTCGGCTTC-3’。內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-CTACA ATGAGCTGCGTGTGG-3’，下游引物：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’。采用兩步法擴(kuò)增程序：95℃30 s，1個(gè)循環(huán);95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán);95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，1個(gè)循環(huán)。

3. 細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染siRNA-BUB1B與對(duì)照組細(xì)胞分別種到6孔板中，每個(gè)細(xì)胞種4個(gè)復(fù)孔，分別在第3、5日將細(xì)胞消化下來，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目畫折線圖。

4. 劃痕實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染siRNA-BUB1B與對(duì)照組細(xì)胞分別種到6孔板中，待細(xì)胞長滿后，用細(xì)胞刮子在每個(gè)孔中按照預(yù)先劃好的輔助線進(jìn)行劃直線，將劃好線的細(xì)胞用無FBS的DMEM培養(yǎng)8 h，顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計(jì)劃痕距離，從而反映細(xì)胞的侵襲能力。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5進(jìn)行作圖以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BUB1B基因的沉默效率檢測，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞數(shù)目），GEO數(shù)據(jù)庫中HCC差異表達(dá)基因以及細(xì)胞遷移距離采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)， P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Kaplan-Meier曲線以及l(fā)og-rank檢驗(yàn)分析BUB1B表達(dá)與HCC患者預(yù)后間的關(guān)系。

結(jié) 果

一、GEO數(shù)據(jù)庫篩選出BUB1B在HCC患者中高表達(dá)

收集GSE121248數(shù)據(jù)集中HCC患者的肝癌組織以及癌旁正常組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析肝癌組織中相比較于癌旁正常組織差異表達(dá)的基因（圖1 A），根據(jù)篩選規(guī)則（P < 0.05，fold change > 2），獲得差異表達(dá)基因表達(dá)的火山圖（圖1B），其中紡錘體檢測點(diǎn)蛋白BUB1B在肝癌組織中明顯高表達(dá)（表1）。

二、BUB1B促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力

BUB1B基因在肝癌組織中高表達(dá)，但是其生物學(xué)作用并不清楚，我們利用小干擾RNA將肝癌細(xì)胞系HepG2中BUB1B基因表達(dá)沉默。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將該小干擾RNA過表達(dá)于HepG2細(xì)胞中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因的沉默效率。沉默序列1（si-BUB1B-1）和2（si-BUB1B-2）均能有效地沉默BUB1B在HepG2中mRNA的表達(dá)（圖2A）（沉默1：t = 8.41， P = 0.001; 沉默2：

t = 10.43，P <0.001）。將低表達(dá)BUB1B基因的HepG2細(xì)胞與對(duì)照組HepG2細(xì)胞分別鋪在6孔板中（2×105），分別在第3、5日用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法反映這兩株細(xì)胞系的增殖能力，我們發(fā)現(xiàn)將BUB1B基因表達(dá)沉默后，細(xì)胞在長到第3日時(shí)細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組細(xì)胞相比并沒有差異（t = 2.60， P = 0.060），而在第5日的時(shí)候，沉默BUB1B表達(dá)的細(xì)胞的增殖能力弱于對(duì)照組細(xì)胞（t = 13.94， P < 0.001），見圖2B。除此之外，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，缺少BUB1B基因表達(dá)的肝癌細(xì)胞，其細(xì)胞侵襲能力與對(duì)照組細(xì)胞相比明顯減弱，見圖2C，劃痕8 h后，細(xì)胞遷移形成的劃痕距離在2株細(xì)胞（對(duì)照組細(xì)胞與沉默2細(xì)胞）中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t = 14.94，P < 0.001），見圖2D。

三、BUB1B是預(yù)測HCC患者預(yù)后的一個(gè)分子標(biāo)志物

BUB1B基因不僅在肝癌細(xì)胞的生長和遷移中具有重要作用，而且在HCC患者預(yù)后中同樣具有重要作用。我們?cè)贙M-plotter數(shù)據(jù)庫中收集了364例HCC患者的預(yù)后以及基因表達(dá)信息，試圖闡明BUB1B在HCC患者預(yù)后中的作用。在HCC患者中（包括肝炎病毒感染者和未感染者），高表達(dá)BUB1B（n = 127）的HCC患者的生存率差于低表達(dá)BUB1B（n=237）的HCC患者[HR = 2.01（1.42 ～ 2.86），P = 6.6×10-5]，見圖3。

肝炎病毒感染是肝癌發(fā)生過程中主要的危險(xiǎn)因素，我們從364例HCC患者中細(xì)分出感染肝炎病毒的HCC患者（n=150）和未感染肝炎病毒的HCC患者（n=167），在2組患者中根據(jù)BUB1B基因表達(dá)的高低分為BUB1B高表達(dá)組和BUB1B低表達(dá)組，通過Kaplan-Meier生存曲線分析，我們發(fā)現(xiàn)只有在未感染肝炎病毒的HCC患者中，BUB1B高表達(dá)組的預(yù)后差于BUB1B低表達(dá)組[HR = 2.84（1.75 ～ 4.61），P =1.1×10-5]，見圖4A。而在感染肝炎病毒的HCC患者中，BUB1B高表達(dá)組與BUB1B低表達(dá)組的生存曲線差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[HR=1.88（0.89 ～ 3.99），P = 0.093]，見圖4B。

討 論

我們研究發(fā)現(xiàn)紡錘體檢測點(diǎn)蛋白BUB1B在肝癌中高表達(dá)，該蛋白的高表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BUB1B分子的表達(dá)可以作為預(yù)測HCC患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)，尤其是未感染肝炎病毒的HCC患者，這為臨床診斷HCC以及判斷HCC患者的預(yù)后提供了理論基礎(chǔ)。

HCC嚴(yán)重威脅人類的生存和健康，尤其是在中國。盡管甲胎蛋白是診斷HCC的最佳標(biāo)志物，但是仍有10% ～ 20%的HCC容易漏診[11]。肝癌診斷的標(biāo)志物比如異常凝血酶原、癌胚抗原、癌抗原（CA199）等在HCC的診斷中具有重要意義[12-14]。除此之外，多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HCC診斷的敏感度以及特異度同樣具有重要的意義。盡管多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用可以輔助診斷HCC，但是由于HCC誘發(fā)因素以及病理類型較復(fù)雜，在診斷肝癌過程中還有許多盲點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)BUB1B在HCC中表達(dá)增加，且與肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)，有望成為診斷的潛在標(biāo)志物。但是BUB1B與甲胎蛋白在HCC中的表達(dá)比較在此并未涉及，后續(xù)研究將集中在比較BUB1B與甲胎蛋白作為HCC診斷分子標(biāo)志物上的差異，闡明BUB1B在診斷某種特定HCC中的作用以及與甲胎蛋白聯(lián)合應(yīng)用診斷HCC的特異性。

HCC發(fā)生過程中的兩大誘因主要是酒精與肝炎病毒的感染[15-16]。肝炎-肝硬化-肝癌是肝癌發(fā)生的三部曲，乙型病毒性肝炎是發(fā)展中國家誘發(fā)肝癌的主要因素，盡管80% ～ 90%的HCC患者是由于慢性肝炎轉(zhuǎn)變成肝硬化的過程中肝細(xì)胞癌化而進(jìn)展成HCC，但是仍有部分HCC患者未曾感染肝炎病毒[17]。肝炎病毒感染誘導(dǎo)HCC的發(fā)生機(jī)制已經(jīng)研究的較為透徹，而未感染肝炎的肝癌發(fā)生機(jī)制反而研究相對(duì)較少[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)BUB1B在未感染肝炎的HCC患者中，可以作為預(yù)測HCC患者預(yù)后的理想分子標(biāo)志物，反而在肝炎病毒感染誘發(fā)的HCC患者中，BUB1B的表達(dá)與HCC患者的預(yù)后沒有太大關(guān)系，該結(jié)果可能暗示肝炎病毒的感染對(duì)BUB1B的分子表達(dá)具有一定影響，我們之后的工作也將主要集中在BUB1B在HCC中表達(dá)的分子機(jī)制。

綜上所述，我們通過HCC患者臨床大數(shù)據(jù)的差異基因篩選，發(fā)現(xiàn)紡錘體檢測點(diǎn)蛋白BUB1B在肝癌中高表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BUB1B的表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲，并且與HCC患者的預(yù)后有關(guān)，尤其是未感染肝炎病毒的HCC患者，該分子的表達(dá)可以作為預(yù)測HCC患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-01-18）

（本文編輯：楊江瑜）