液相色譜校準(zhǔn)曲線法檢測(cè)藥物殘留時(shí)不確定度的評(píng)估與分析

方強(qiáng)　丁成　黃芳　章雪明

[摘要]本文從檢測(cè)全過程及儀器定量原理的角度出發(fā)，評(píng)估了液相色譜法測(cè)定鱸魚中3種喹諾酮類藥物殘留時(shí)的不確定度。研究結(jié)果表明，諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星3類參數(shù)校正點(diǎn)相對(duì)不確定度分別占合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的5.6%、34.2%、1.7%;藥物殘留含量計(jì)算值相對(duì)不確定度分別占合成相對(duì)不確定度的4.9%、22.9%、18.0%;回收率引入相對(duì)不確定度分別占合成相對(duì)不確定度的89.4%、42.9%、80.3%。

[關(guān)鍵詞]液相色譜校準(zhǔn)曲線法;檢測(cè)藥物殘留;不確定度

中圖分類號(hào)：TS207

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190408

藥物殘留檢驗(yàn)系符合性檢驗(yàn)，當(dāng)測(cè)試結(jié)果處于規(guī)定指標(biāo)臨界值附近時(shí)，測(cè)量不確定度對(duì)判斷結(jié)果符合性會(huì)產(chǎn)生影響。2016年1月1日實(shí)施的《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評(píng)審準(zhǔn)則》明確提出了不確定度的要求，準(zhǔn)確評(píng)估測(cè)量不確定度對(duì)藥物殘留檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)具有重要意義。

藥物殘留的檢驗(yàn)檢測(cè)通常具有較為復(fù)雜的前處理過程，進(jìn)而使檢驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果出現(xiàn)誤差。規(guī)范相關(guān)的檢驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)雖然會(huì)給出回收率允許的參考范圍，但是一般都未要求對(duì)范圍內(nèi)的非100%回收進(jìn)行校正，誤差就轉(zhuǎn)化為測(cè)量不確定度。

本文從一般殘留試驗(yàn)全過程及儀器定量原理的角度出發(fā)，參考汪輝等藥物殘留不確定度評(píng)估方法，解析了液相色譜校準(zhǔn)曲線法檢測(cè)藥物殘留時(shí)不確定度的來源，并以鱸魚中3種喹諾酮類藥物殘留為例，按GUM法評(píng)估了測(cè)量不確定度，為同類型的藥物殘留檢驗(yàn)提供了一定的參考作用。

1藥物殘留檢測(cè)一般過程

藥物殘留檢測(cè)一般過程見圖1。

2測(cè)量模型和不確定度來源

2.1測(cè)量模型

試樣中藥物殘留計(jì)算公式：

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度

（2）高濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度

（3）低濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度

由公式（1）和公式（2）可得校準(zhǔn)曲線高濃度的3個(gè)點(diǎn)：

由公式（11）和公式（3）可得低濃度的3個(gè)點(diǎn)：

（4）校準(zhǔn)曲線線性回歸方程

（5）試樣測(cè)定濃度

（6）試樣含量計(jì)算值

（7）陽性添加樣品添加含量

（8）回收率

（9）試樣真實(shí)含量

式中：C儲(chǔ)為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度，μg/mL;m標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量，g;P為標(biāo)準(zhǔn)品的純度;MW為純物質(zhì)分子量;MW2為帶其他基團(tuán)后的分子量;V容1為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容體積，mL;e使為高濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液的濃度，μg/mL;V移1為移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的體積，mL;V容2為高濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液的定容體積，mL;c'使為低濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度，μg/mL;V'移1為移取高濃度使用液配制低濃度使用的體積，mL;V'容2為低濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液的定容體積，mL;C點(diǎn)為校準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的濃度，ng/mL;V移2為校準(zhǔn)曲線各點(diǎn)移取的標(biāo)準(zhǔn)使用液的體積，μL;V容3為校準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的定容體積，mL;y為峰面積;a為校正曲線的截距;b為斜率;V容4為測(cè)定液的定容體積，mL;V移了為陽性添加樣品加標(biāo)體積;X因?yàn)殛栃詷悠诽砑雍?X為試樣藥物殘留的含量;fp為平均回收率和期望值100%偏差的校正因子;fg為校正曲線配制過程中校正點(diǎn)誤差校正因子。

2.2不確定度來源

由公式（11）可知，不確定度的來源包括含量計(jì)算值的不確定度、回收率的不確定度和校正點(diǎn)的不確定度。

3鱸魚中3種喹諾酮類藥物殘留測(cè)定時(shí)不確定度評(píng)定

3.1實(shí)驗(yàn)

3.1.1材料與試劑

試驗(yàn)樣品為鱸魚;諾氟沙星（Nor）、鹽酸環(huán)丙沙星（Cip）、恩諾沙星（Enr）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液均由Dr.Ehrenstorfer公司的固體標(biāo)準(zhǔn)品配制而成;鹽酸、無水硫酸鈉（經(jīng)650C灼燒烘干）為分析純;乙腈、正已烷、磷酸、三乙胺為色譜純?cè)噭?酸化乙腈（乙腈：鹽酸=250：1）;0.34%磷酸水溶液（經(jīng)三乙胺調(diào)節(jié)pH值至2.4）;試驗(yàn)用水均符合GB/T6682-2008131-級(jí)水的要求。

3.1.2儀器與設(shè)備

e2695液相色譜儀、2489熒光檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司;BSA2202S-CW百分之一電子天平、十萬分之一電子天平：德國(guó)賽多利斯公司;XcelVap自動(dòng)濃縮工作站：美國(guó)Horizon公司;0.2μmx13mmNYL慮頭：英國(guó)Whatman公司。

3.1.3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及校正曲線配制

分別稱取0.00503g的Nor、0.00582g的Cip.0.00504g的Enr固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于3個(gè)50mL容量瓶中，用2%甲酸一甲醇溶液溶解定容，濃度均為100μg/mL。分別吸取Nor和Enr標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5mL、Cip標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL于50mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容得Nor和Enr濃度為10μg/mL、Cip濃度為2μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液;吸取該混合標(biāo)準(zhǔn)工作液200μL于5mL指形管中，用1mL移液槍分2次吸取900μL流動(dòng)相定容，得Nor和Enr濃度為1.0μg/mL.Cip濃度為0.20μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別移取上述濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各25μL、50μL、100μL于6個(gè)2mL進(jìn)樣瓶中，用1mL移液槍移取流動(dòng)相定容至1mL，得Nor和Enr濃度為25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL，Cip濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的校準(zhǔn)溶液系列。

所用容量瓶為A級(jí)硼硅玻璃。流動(dòng)相的水溫為21～25%C。3種喹諾酮類藥物校正曲線回歸方程如下：（1）Nor：y=145596x+2638353，r=0.999899，其中y為峰面積，x為濃度，斜率b=145596，截距a=2638353。（2）Enr：y=220610x+9215728，r=0.999878，其中y為峰面積，x為濃度，斜率b=220610，截距a=9215728。（3）Cip：y=121276x+398669，r=0.999855，其中y為峰面積，x為濃度，斜率b=121276，截距a=398669。

3.1.4樣品處理及測(cè)定

陰性對(duì)照樣品和陽性添加樣品各7個(gè)重復(fù)，陽性添加樣品加人0.15mL的Nor和Enr濃度為1.0μg/mL、Cip濃度為0.20μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液作為陽性添加試驗(yàn)。

（1）前處理。稱取5g樣品，置于50mL離心管中，加入6g無水硫酸鈉，25mL酸化乙腈，振搖10min，8000r/min離心5min，取上清液，氮吹至干，1mL流動(dòng)相定容，3mL正已烷抽脂，下層液過濾頭待測(cè)。

（2）測(cè)定。本次測(cè)定采用校正曲線法定量，流動(dòng)相為乙腈和0.34%磷酸一水溶液（15：85）的混合溶液。色譜柱：WatersXBridgeC184.6μmx250mm;流速：1.0mL/min;柱溫：35%C;進(jìn)樣量：20μL;進(jìn)樣時(shí)間：30min;激發(fā)波長(zhǎng)：280nm;發(fā)射波長(zhǎng)：450nm。

（3）數(shù)據(jù)。方法偏差試驗(yàn)結(jié)果見表1。

（4）數(shù)據(jù)檢驗(yàn)。采用Grubbs檢驗(yàn)法對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均無異常。

3.2不確定度評(píng)定

3.2.1校正點(diǎn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本文所用校正曲線的6個(gè)點(diǎn)中，低濃度3個(gè)點(diǎn)較高濃度3個(gè)點(diǎn)多一步稀釋，故低濃度點(diǎn)的不確定度應(yīng)大于高濃度點(diǎn)，本文取低濃度點(diǎn)中不確定度最大點(diǎn)作為校正點(diǎn)的不確定度。根據(jù)公式（5）可得校正點(diǎn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

因V'容2和V。容3的定容實(shí)際為一個(gè)移液過程，V移1和V稱2引人的不確定度可包含在V容2和V容3中，則：

本文所用Cip標(biāo)準(zhǔn)品帶鹽酸基團(tuán)，故應(yīng)計(jì)算MW引人的不確定度，其余標(biāo)準(zhǔn)品為純物質(zhì)，不需要考慮（取均勻分布k=√3）。查元素周期表（2005年）計(jì)算后得：u（MW|）2=3.7573x10-6

標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2（m標(biāo)）見表2。十萬之一天平稱量5g以下時(shí)允差為+0.5e，本文采用減量法稱量標(biāo)準(zhǔn)品，取三角分布，故：

式中：m標(biāo)表示各標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量，go標(biāo)準(zhǔn)品純度P引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)定度：

查標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書：Py;99.1%，Uo=1.0%（k=2）;Pem=99.1%，Up=1.0%（k=2）;Pcar=94.0%，Ucn=1.0%（k=2）。則有Nor：u（P）=0.5，u（P）=2.546x10～;Enr：u（P）=0.5，12（P）=2.551x10～;Cip：.u（P）=0.5，u（P）=2.829x10～。

構(gòu)成體積V不確定度u（V）主要分量有3個(gè)：量器示值偏差引人的不確定度u（AV示），配制溶液時(shí)溶液溫度偏離標(biāo)準(zhǔn)溫度引人的工標(biāo)體積差不確定度u（AV工），使用溶液時(shí)的液溫偏離配制溶液時(shí)的液溫引人的溫變體積差不確定度u（AV;溫）。本試驗(yàn)室有中央控溫系統(tǒng)，且在同一天完成，查當(dāng)日的溫度監(jiān)控記錄，溫度變化為21～25%C。

u2（V）=u2（AV示）+u2（AV⊥）+u？（AV溫）（21）（1）量器示值偏差的不確定度u（AV示）。查JJG646-2006/41和JJG196-200651得到所用量器的容量V，允差，取三角分布，k=√6，示值偏差引人的標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。

（2）工標(biāo)體積差的不確定度Iu（（△V工）。由于水、甲醇和乙腈的密度隨溫度變化呈非線性，用體積膨脹法計(jì)算溫度變動(dòng)導(dǎo)致甲醇溶液和水-乙腈混合溶液（流動(dòng)相）的體積變化是不合適的。根據(jù)密度定義式推導(dǎo)出體積變化算式，再用密度修正值代替密度值便可進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)算。其中，乙腈-水的密度隨溫度變化表沒有查到，參考甲醇-水的密度變化表。K（t）根據(jù)JJG646-200641和JJG196-200651計(jì)算公式得到。容量瓶為硅硼玻璃，取三角分布。根據(jù)使用的量器和液體種類的不同，代人公式計(jì)算后，工標(biāo)體積誤差不確定度見表4。

（3）溫變體積誤差的不確定度見表5。

（4）體積V不確定度u（V）合成。根據(jù)定容或移液的體積、量器的材質(zhì)以及液體種類計(jì)算，結(jié)果見表6。

（5）計(jì)算濃度和期望濃度誤差引人的不確定度。試驗(yàn)過程中標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算濃度和期望濃度是有差異的，但為了方便計(jì)算、本文直接以期望濃度賦予各校正點(diǎn)濃度，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)該行為引人的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度在最低濃度點(diǎn)最大，故代人公式計(jì)算后（取均勻分布），數(shù)據(jù)見表7。

3.2.2藥物殘留含量計(jì)算值引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

藥物殘留含量計(jì)算值引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

測(cè)定濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

式中：S成為校正曲線的殘余偏差;p為試驗(yàn)重復(fù)次數(shù);n;為校正曲線的點(diǎn)數(shù);文校為校正曲線各濃度點(diǎn)數(shù)值的平均值;x;為校正曲線各點(diǎn)的濃度值;y;為校正曲線個(gè)點(diǎn)的峰面積;c為測(cè)定濃度的平均值。

將數(shù)據(jù)代人公式，得Nor：S殘=8.712x10';Enr：s殘=1.448x10*;Cip：sa=5.166x10'。Nor：u（c測(cè)）=3.616，un2（C測(cè)）=0.02958;Enr：u（c測(cè)）=3.877，Urel（C測(cè)）=0.02514;Cip：u（c測(cè)）=2.602，uu（c測(cè)）=0.1201。

（2）u2（Vw4）的計(jì)算。V容4定容實(shí)際為一個(gè)移液過程，且3類化合物的不確定度都相同，故u2（V容4）=1.757x10～。

（3）稱量試樣時(shí)引人的不確定度：

式中：m樣為稱樣量，m樣為陰性對(duì)照樣品和陽性添加樣品稱樣量的平均值，為5.00g。百分之一天平允差為+0.5e，取三角分布，則：u2（m樣）=（0.05+√6）2=8.333x10+，u2（m程）=1.67x10-

（4）儀器引人的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。液相色譜重復(fù)定量測(cè)定RSD≤3%（本文取3%），根據(jù)A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算公式可得儀器引人的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u2（f儀器）=（0.03+√6）2=1.5x10-2

（5）u2（X計(jì)）的合成。Nor：u2（X計(jì)）=1.05x10*;Enr：u（X計(jì)）=8.16x10*;Gip：u（X）=1.46x10-2。

3.2.3回收率引入的相對(duì)不確定度

回收率引人的相對(duì)不確定度：

（1）回收率與期望值差異引人的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。對(duì)各參數(shù)的回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，其中：

式中：S回收率為回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，R為回收率的平均值，R。為回收率期望值（R.=100%），t為置信因子。結(jié)果表明，Nor、Cip的回收率與期望值存在顯著性差異，即引人了不確定度;Enr不存在顯著性差異，即引人的不確定度可忽略。計(jì)算數(shù)據(jù)取均勻分布，結(jié)果見表8。

（2）陰性和陽性對(duì)照樣品在回收率計(jì)算中引人的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uuea（X陰）和un2（X陽）。陰性對(duì)照樣品參數(shù)含量值接近0，本文認(rèn)為其不確定度為儀器的不確定度，2（Xp）+u2（f儀器）=1.5x10+。陽性添加樣品uoa（Xp）與un（X+）是相同的，Nor：u2（Xq）=1.05x10～;Enr：品（X陽）=8.16x10*;Cip：疏（X陽）=1.46x10～。

（3）添加含量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。根據(jù)公式（9）可得：

（4）回收率重復(fù)性引人的相對(duì)不確定度。將表8中的R、S回收率代人公式：

3.2.4相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

4結(jié)論

（1）Nor、Enr、Cip（以下數(shù)據(jù)如無特殊說明均按此順序排列）3個(gè)參數(shù)校正點(diǎn)相對(duì)不確定度分別占合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的5.6%、34.2%、1.7%;藥物殘留含量計(jì)算值相對(duì)不確定度分別占合成相對(duì)不確定度的4.9%、22.9%、18.0%;回收率引入相對(duì)不確定度分別占合成相對(duì)不確定度的89.4%、42.9%、80.3%。因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)帶有非目標(biāo)的基團(tuán)而引人的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度較小，可忽略不計(jì)，因移液、定容等體積因素引入的相對(duì)不確定度占校正點(diǎn)相對(duì)不確定度分別為96.7%、96.7%、86.9%，其中因V容3-Iml，引人的不確定度占該類相對(duì)不確定度的92%、92%、91.2%，故在校正點(diǎn)配制過程因移液、定容等體積因素引人的相對(duì)不確定度中可僅考慮V容3-Iml.引人的不確定度8-1藥物殘留含量的計(jì)算值引入的相對(duì)不確定度中的22（C測(cè)）和u2（f儀器）之和分別占該類相對(duì)不確定度的97.6%、95.8%、99.8%，故在22（X計(jì)）的計(jì)算過程中可僅考慮這兩類的不確定度。回收率引人的相對(duì)不確定度Nor和Cip分別是Enr的6倍和23倍，這一問題主要是由于Nor和Cip的回收率均值與期望值存在顯著性差異，該差異引人的相對(duì)不確定占Nor和Cip回收率相對(duì)不確定度91.2%、75.3%。3個(gè)參數(shù)的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度排序?yàn)镃ip>Nor>Enr，且彼此之間差距明顯。藥物殘留含量測(cè)定過程中相對(duì)不確定度大小主要是由樣品中殘留藥物濃度大小和實(shí)際檢出含量和真實(shí)含量之間的差異決定的，后者無法量化，故引人加標(biāo)回收來解決這一問題。

（2）由不確定度評(píng)定過程可知，不確定度大小與試驗(yàn)流程嚴(yán)格對(duì)應(yīng)，試驗(yàn)流程所涉及的步驟越多則引人的不確定度越多，為確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，整個(gè)試驗(yàn)流程應(yīng)盡可能簡(jiǎn)化。

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