腎茶飲片的質(zhì)量標準研究

林青華 張永怡 周 慧 蔣 林*

1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200

腎茶，又名貓須草，為唇形科植物腎茶Clerodendranthusspicatus(Thunb)C.Y.Wu ex H.W.Li的干燥地上部分，具有清熱祛濕、排石通淋的功效[1]。腎茶含有黃酮、酚類、萜類、揮發(fā)油等多種化學成分，具有調(diào)節(jié)腎功能、利尿排石、抗炎、抗菌等多種藥理活性[2-3]，開發(fā)前景廣闊。然而，腎茶飲片的質(zhì)量標準并不完善，其中安徽[4]、云南[5]、四川[6]的飲片標準缺失“灰分”和“含量測定”，湖南[7]的飲片標準缺失“水分”“灰分”和“含量測定”，福建[8]、寧夏[9]的飲片標準僅有“性狀”要求，這不利于質(zhì)量控制和產(chǎn)品開發(fā)。本文按2020年版《中國藥典》(四部)通則(下文簡稱藥典)中的相關(guān)規(guī)定[10]，對不同產(chǎn)地的10批腎茶飲片進行定性鑒別與定量研究，以期為完善腎茶飲片的質(zhì)量標準提供參考與依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 10批腎茶藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室朱意麟老師鑒定為唇形科植物腎茶Clerodendranthusspicatus(Thunb)C. Y.Wu ex H. W. Li的干燥地上部分，具體見表1。迷迭香酸對照品(批號MUST-19053107，純度>98.0%)購于中國科學院成都生物研究所。

表1 10批腎茶藥材編號與來源

1.2 儀器與試劑 Agilent-1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Ultimate?XB-C18色譜柱[月旭科技(上海)股份有限公司]，乙腈[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，Direct-Q5UV超純水儀一體機(廣西南寧博美生物科技有限公司)，DMB-1223型生物顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)，ME204E型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，KQ-500E超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，硅膠G板(青島海洋化工有限公司)，甲醇、甲苯、甲酸、乙酸乙酯、水合氯醛、磷酸等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 10批腎茶藥材噴淋適量清水軟化，切長段，干燥；按藥典“0212藥材和飲片檢定方法”對其進行描述。本品為不規(guī)則的段、莖、葉混合。莖呈四棱形或類圓形，直徑0.2～1.5 cm，外表皮紫褐色，有細縱線，有的有分支，切面周圍黃白色至淺綠色，髓部類白色。葉對生，褐綠色，多破碎，完整者展平后呈卵形或卵狀披針形，長2～5 cm，寬1～3 cm，兩面呈黃綠色或暗綠色，葉脈紫褐色，均有小柔毛，先端尖，基部楔形，中部以上葉片邊緣鋸齒狀，葉柄長約2 cm。輪傘花序偶見。氣微，味微苦。具體如圖1所示。

圖1 腎茶飲片圖

2.2 顯微鑒別 按藥典“2001顯微鑒別法”對腎茶飲片的粉末進行鑒別。本品粉末呈綠褐色。表皮細胞類圓形或類方形，可見不定式氣孔。非腺毛較多，單細胞，散在，多碎斷，完整者基部細胞粗短膨大，壁較厚，有疣狀突起，長85～175 μm。薄壁細胞內(nèi)含草酸鈣簇晶，常排列成行，也有的單個散在，直徑8～18 μm?？梢娐菁y或環(huán)紋導管，以螺紋導管為主，常見于葉肉細胞中。偶見棕色塊，類圓形，顏色深淺不一。如圖2所示。

1.表皮細胞；2.草酸鈣蔟晶；3.纖維組織；4、5.導管；6.氣孔；7.非腺毛；8.腺毛

2.3 薄層鑒別 取腎茶飲片粗粉0.5 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取迷迭香酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。照藥典“0502薄層色譜法”規(guī)定，吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶3∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各供試品、對照品在硅膠G板的相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，但各樣品迷迭香酸的斑點深淺不一，說明其含量不盡相同。如圖3所示。

圖3 腎茶飲片供試品(1～10)與迷迭香酸對照品(R)在365 nm處的薄層色譜圖

2.4 水分、灰分和浸出物的測定 按照藥典“0832水分測定法(烘干法)”“2302灰分測定法”“2201浸出物測定法(水溶性浸出物，熱浸法)”對其水分、總灰分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物進行測定。檢測結(jié)果，具體見表2。根據(jù)極值上、下浮動20%的原則，擬定腎茶飲片的水分、總灰分和酸不溶性灰分含量分別不得超過15.0%、11.0%、0.6%，水溶性浸出物含量不得低于17.0%。

表2 腎茶飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分與水溶性浸出物的含量

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 取迷迭香酸適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備 取腎茶飲片粉末(過五號篩)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理0.5 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 色譜條件 Ultimate?XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸水溶液(25∶75)為流動相，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫35℃，檢測波長330 nm。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸0.5 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、10 mL“5.1”項下的對照品溶液分別置10 mL容量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液按“5.3”項下色譜條件分別進樣，以峰面積(A)為縱坐標，濃度(μg/mL)為橫坐標，計算迷迭香酸的回歸方程為Y=28251X-15.812(r=0.9996)，說明迷迭香酸在118.72～4.24 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對照品及供試品的高效液相色譜圖。如圖4所示。

圖4 迷迭香酸對照品(A)與腎茶飲片供試品(B)的HPLC圖譜

2.5.5 精密度考察 取“5.4”項下同一濃度對照品溶液，按“5.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，按峰面積計算迷迭香酸的相對準偏差(RSD)為0.46%，說明儀器精密度良好。

2.5.6 重復性試驗 取同一批腎茶飲片樣品按“5.2”項下方法，平行制備6份供試品，按“5.3”項下色譜條件進樣，按峰面積計算迷迭香酸RSD =0.66%，說明該方法重復性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“5.3”項下色譜條件進樣，按峰面積迷迭香酸RSD =1.53%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 加樣回收試驗 取已知迷迭香酸含量的腎茶飲片樣品，分別加入定量的迷迭香酸對照品，按“5.2”項下方法平行制備6份供試品，按“5.3”項下色譜方法進樣，計算迷迭香酸的平均回收率為99.32%，RSD=1.61%，說明供試品的制備方法能將腎茶飲片中的迷迭香酸提取完全。

2.5.9 樣品含量測定 按“5.2”項下方法制備各批腎茶飲片的供試品溶液，根據(jù)“5.3”項下色譜條件進樣，計算其迷迭香酸的含量。結(jié)果表明，10批腎茶飲片的迷迭香酸的含量為1.05%～0.05%。具體見表3。鑒于SC10樣品的迷迭香酸含量過低，舍棄，故按迷迭香酸含量下限值(0.19%)的80%制訂限量標準，擬定腎茶飲片中迷迭香酸的含量不得低于0.16%。

表3 10批腎茶飲片中迷迭香酸的含量

3 討論

迷迭香酸具有抑制和改善大鼠草酸鈣型腎結(jié)石的作用[11-12]，其與腎茶排石通淋的功效相一致，故本文以迷迭香酸為對照品進行薄層鑒別和含量測定。

本文在優(yōu)選薄層色譜展開劑的過程中，對石油醚/環(huán)己烷-乙酸乙酯、二氯甲烷/氯仿-甲醇、甲苯-乙酸乙酯等展開系統(tǒng)進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶3∶0.8)為展開劑時，薄層展開效果最好，迷迭香酸對照品的比移值適中，供試品斑點分離明顯，故選此為展開劑進行薄層鑒別。

為優(yōu)選含量測定過程中最佳的供試品制備方法，本文對提取溶劑、料液比、提取方法、提取時間和提取次數(shù)進行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100倍量50%甲醇超聲提取腎茶飲片0.5 h即可將其迷迭香酸提取完全，故選此法制備供試品。

本文以不同比例的甲醇(乙腈)-水(磷酸水)為流動相，優(yōu)選腎茶飲片中迷迭香酸的HPLC條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水(25∶75)為流動相時，供試品中迷迭香酸的分離效果好(R>1.5)且出峰時間(tR=10.10 min)適中，故選此為流動相測定腎茶飲片的迷迭香酸。

4 結(jié)論

本實驗分別對腎茶飲片的性狀、顯微、薄層鑒別及水分、灰分、浸出物、迷迭香酸含量進行測定，為完善腎茶飲片的質(zhì)量標準提供了實驗依據(jù)。本實驗所建立的關(guān)于腎茶飲片的定性和定量研究方法穩(wěn)定、可靠，也為完善腎茶飲片質(zhì)量標準提供了參考。