2008—2012年上海市腸炎沙門氏菌分離株毒力基因篩查與ERIC-PCR分型

莊孝飛，周秀娟，許學(xué)斌，史賢明，施春雷，*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，陸伯勛食品安全研究中心，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240；2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336）

2008—2012年上海市腸炎沙門氏菌分離株毒力基因篩查與ERIC-PCR分型

莊孝飛1，周秀娟1，許學(xué)斌2，史賢明1，施春雷1，*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，陸伯勛食品安全研究中心，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240；2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336）

采集上海地區(qū)2008—2012年來自臨床病人和市售食品的腸炎沙門氏菌分離株90 株；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法，對存在于毒力島SPI和毒力質(zhì)粒上的9 種常見毒力基因攜帶情況進行了調(diào)查；并采用本實驗優(yōu)化的腸桿菌基因間保守重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR）方法對這些分離株進行亞分型。結(jié)果顯示：毒力基因invH、sopE、sugR的攜帶率為100.0%（90/90），iacP、avrA、rhuM、prgK均為98.9%（89/90），而spvB、spvC分別為85.6%（77/90）和78.9%（71/90）。優(yōu)化的ERIC-PCR體系能夠較好地區(qū)分8 種主要沙門氏菌血清型，共17 株菌，辛普森指數(shù)（D值）為0.970 6。然而，90 株腸炎沙門氏菌分離株卻具有一致的ERIC-PCR指紋圖譜。在所調(diào)查分離株中，毒力基因的攜帶率較高，尤其是invH、sopE和sugR，對人類健康存在較大威脅；ERIC-PCR雖然可用于區(qū)分沙門氏菌不同血清型，但對腸炎沙門氏菌的分型效果不佳。

腸炎沙門氏菌；毒力基因；ERIC-PCR分型

沙門氏菌是引發(fā)食物中毒的主要食源性致病菌之一，目前已確認(rèn)的血清型有2 600多種，其中腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌是全世界范圍內(nèi)最常見的血清型，具有重要的流行病學(xué)意義［1］。在我國，腸炎沙門氏菌SalmonellaEnteritidis成為近年來引發(fā)沙門氏菌病大爆發(fā)的主要血清型。根據(jù)文獻報道，2006—2007年上海市非傷寒沙門菌病病例中腸炎沙門氏菌占據(jù)首位［2］，80%食源性分離株來自于禽及禽肉制品。同時，食物一旦污染沙門氏菌也會造成巨大經(jīng)濟損失，例如：1996年在我國向歐洲出口的兔肉中發(fā)現(xiàn)了腸炎沙門氏菌，經(jīng)濟損失達3 000萬 元［3］。

腸炎沙門氏菌具有很強的致病性，許多毒力因子（如脂多糖、腸毒素、細(xì)胞毒素以及毒力蛋白等）的存在與相互作用是導(dǎo)致其致病的罪魁禍?zhǔn)祝?-5］，嚴(yán)重威脅人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，毒力基因主要分布在毒力島和毒性質(zhì)粒上［6］，SPI-1～SPI-5是研究的比較多的5 個毒力島。其中SPI-1全長約40 kb，至少編碼29 個毒力基因，如inv、sic、iac、spt、iag、orf、prg、avr等，這些毒力基因編碼的蛋白與腸炎沙門氏菌的侵襲力有關(guān)［7］。SPI-3大小約為17 kb，可編碼SugR、RhuM等多個毒力因子，與沙門氏菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)的存活相關(guān)［8］。小鼠毒力試驗亦證明，腸炎沙門氏菌毒力質(zhì)粒上的毒力基因?qū)σl(fā)疾病也具有重要作用［9］。在毒力質(zhì)粒上，與致病性相關(guān)的spv（Salmonella plasmid virulence）基因有6 個開放閱讀框（spvA、spvB、spvC、spvD、orfE、spvR）［10］。不同來源的沙門氏菌對小鼠有不同的致病性，對人類的危害程度也不相同［11］，因此，研究不同來源腸炎沙門氏菌毒力基因攜帶情況對上海地區(qū)腸炎沙門氏菌風(fēng)險預(yù)警和危害控制具有重要意義。

腸桿菌基因間保守重復(fù)序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）是普遍存在于腸道細(xì)菌中，大小約為124～127 bp，在基因組中ERIC的分布和拷貝數(shù)具有種屬特異性，因而可用于對基因組進行分析研究［12］。Versalovic等［13］針對這些序列設(shè)計引物進行PCR擴增，將這一技術(shù)用于細(xì)菌基因組DNA的指紋圖譜分析，具有精確、快速、簡便等優(yōu)點，并被廣泛地應(yīng)用于菌種鑒別與病原菌的溯源研究中［14-15］。Lim等［16］通過研究隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA， RAPD）、ERIC、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、核糖體分型4 種分型方法發(fā)現(xiàn)，ERIC-PCR對沙門氏菌不同血清型有很好的分型效果。同樣方法，陳玲等［17］把96 株沙門氏菌分離株分為15 個簇，56 種基因型。而Chmielewski等［18］利用ERIC-PCR將31 株禽源的腸炎沙門氏菌分成3 個基因群。借助分型可以對不同來源和不同血清型甚至不同致病力的沙門氏菌加以區(qū)分，對沙門氏菌的風(fēng)險預(yù)警和危害控制同樣具有重要意義。

本研究在上海不同地區(qū)，采集2008—2012年的食源性和醫(yī)源性腸炎沙門氏菌分離株，從中隨機挑選出90 株用于后續(xù)實驗。通過對分離株毒力島（SPI-1、SPI-3）及毒力質(zhì)粒的毒力基因invH、sopE、iacP、prgK、avrA、 sugR、rhuM、spvB、spvC進行PCR擴增，來調(diào)查上海市腸炎沙門氏菌毒力基因的攜帶情況，并探索了ERIC-PCR分子分型技術(shù)對沙門氏菌血清型的分型能力，之后對90株不同年份不同來源的腸炎沙門氏菌進行ERIC-PCR分型，調(diào)查2008—2012年腸炎沙門氏菌菌株之間的差異。

1　材料與方法

1.1菌株

圖1　2008—2012年上海地區(qū)90 株腸炎沙門氏菌9 種毒力基因分布圖Fig.1　Distribution of 9 virulence genes in 90 Salmonella Enteritidis isolates during 2008 to 2012 in Shanghai

2008—2012年在上海地區(qū)采集市售食品及臨床患者樣品，并從中分離食源性與醫(yī)源性腸炎沙門氏菌共90 株，所有研究的腸炎沙門氏菌菌株都是隨機挑選的，菌株編號見圖1。另外，隨機挑選腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鴨沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌8 種沙門氏菌血清型菌株共17 株用于ERIC-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，菌株編號見表1。

表1　8種沙門氏菌血清型菌株Table1　Strains of eight Salmonella serovars

1.2試劑與儀器

Taq DNA聚合酶 立陶宛Fermentas公司；100/200 bp DNA Ladder分子量標(biāo)準(zhǔn) 天根生化科技（北京）有限公司。

ABI 9700 PCR擴增儀 美國AB公司；5415D臺式微量離心機 德國Eppendorf公司；PS2A200核酸電泳儀 美國Hoefer公司；GIS2020凝膠成像儀 上海天能公司；EQR/GL-41超凈工作臺 新加坡Esco公司。

1.3方法

1.3.1腸炎沙門氏菌PCR驗證

1.3.1.1引物序列

根據(jù)本研究室已發(fā)表的腸炎沙門氏菌特異性靶點SEN1392的引物，引物序列詳見表2。

表2　本研究所使用的PCR引物序列列表Table2　The primer sequences used in this study

續(xù)表2

1.3.1.2PCR反應(yīng)體系與參數(shù)

PCR體系：10×buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.5 μL，上下游引物（各10 μmol/L）均為0.5 μL，Taq DNA聚合酶（1 U/μL）1 μL，模板為2.5 μL，總體積為25 μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 次循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物，在電壓為170 V條件下，進行凝膠瓊脂電泳20 min，其中凝膠為1.5%瓊脂糖，最后溴化乙錠（0.5 mg/L）染色后成像觀察，所參照的DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為100 bp DNA Ladder。

1.3.2腸炎沙門氏菌毒力基因檢測

沙門氏菌常見的毒力基因引物序列參見表2，PCR反應(yīng)體系與參數(shù)參考1.3.1.2。

1.3.3ERIC-PCR分子分型

1.3.3.1ERIC-PCR引物序列

參見表2。

1.3.3.2ERIC-PCR反應(yīng)體系與參數(shù)

反應(yīng)總體積25 μL：10×buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（各10 μmol/L）均為0.5 μL，Taq DNA聚合酶（1 U/μL）1 μL，模板為2.5 μL，其余用ddH2O補齊。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，52℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，共進行35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.3.3.3ERIC-PCR產(chǎn)物檢測

取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 10×上樣緩沖液混勻后，在1.5%的瓊脂糖凝膠上，以140 V電壓條件，電泳1 h，最后溴化乙錠（0.5 mg/L）染色后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并成像。

1.3.3.4ERIC-PCR指紋圖譜分析

確定ERIC-PCR電泳圖譜在相同分析區(qū)域內(nèi)的條帶數(shù)目及相對位置，對不同腸炎沙門氏菌進行ERIC-PCR電泳條帶分析。

2　結(jié)果與分析

2.1腸炎沙門氏菌PCR驗證

2008—2012 年采集上海地區(qū)不同來源樣品的90 株食源性與醫(yī)源性腸炎沙門氏菌分離株，經(jīng)PCR驗證，菌株均有SEN1392基因擴增條帶，結(jié)果如圖2所示。圖2中的條帶明亮單一，且大小與Liu Bin等［19］的結(jié)果完全一致，可以確定為腸炎沙門氏菌。

圖2　部分腸炎沙門氏菌分離株P(guān)CR驗證結(jié)果Fig.2　PCR confirmation results for part of Salmonella Enteritidis isolates

2.2腸炎沙門氏菌毒力基因的檢測

對90 株腸炎沙門氏菌毒力島SPI-1、毒力島SPI-3及毒力質(zhì)粒上的9 種毒力基因（invH、sopE、iacP、prgK、avrA、sugR、rhuM、spvB、spvC）進行PCR檢測，并計算每種毒力基因的攜帶率。檢出結(jié)果（圖1）顯示：在90 株腸炎沙門氏菌中，均攜帶有毒力基因invH、sopE與sugR，攜帶率為100.0%；89 株均含有iacP、avrA、rhuM、prgK的擴增條帶，其中2011年醫(yī)源菌株SJTUF11446無iacP擴增條帶；2010年食源菌株SJTUF10999無prgK擴增條帶，醫(yī)源菌株SJTUF10797無avrA條帶；2008年食源菌株SJTUF11323無rhuM，表明這4 種毒力基因的攜帶率為98.9%；與Han等［22］對采集于醫(yī)源、雞肉、農(nóng)場的54 株腸炎沙門氏菌毒力基因檢測結(jié)果一致，攜帶率均在98.0%～100.0%之間，高于Zou Wen等［20］40.0%～80.0%的結(jié)果。攜帶位于毒力質(zhì)粒上的毒力基因spvB、spvC的菌株數(shù)目分別為77與71，攜帶率分別為85.6%與78.9%，71 株菌同時攜帶spvB和spvC兩種毒力基因，概率為78.9%。而本研究中spvB 85.6%的攜帶率介于Han等［22］100.0%的spvB攜帶率和楊勁松等［23］43.3%的攜帶率之間，78.9%的spvC攜帶率略高于劉芳萍等［24］68.2%的spvC攜帶率，這些差異可能與采集的樣品來源及腸炎沙門氏菌區(qū)域差異有關(guān)。

2.3沙門氏菌ERIC-PCR分型

本研究利用ERIC-PCR技術(shù)對8 種沙門氏菌血清型進行擴增，包括腸炎沙門氏、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌和鴨沙門氏菌共17 株。如圖3所示，ERIC-PCR指紋圖譜擴增條帶清晰，每株菌的條帶大小都在100～4 000 bp之間，擴增條帶數(shù)介于11～22之間不等。

圖3　8種沙門氏菌血清型ERIC-PCR指紋圖譜Fig.3　ERIC-PCR profiles for eight Salmonella serovars

從條帶分布上來看，除傷寒沙門氏菌與鴨沙門氏菌外其他沙門氏菌血清型條帶分布都比較均勻。通過BioNumerics軟件將ERIC-PCR指紋圖譜繪制成UPGMA聚類樹，并進行遺傳進化關(guān)系分析，如圖4所示。

圖4　8種沙門氏菌血清型ERIC-PCR分型聚類分析結(jié)果Fig.4　UPGMA tree of ERIC-PCR subtyping among 8 Salmonella serovars

根據(jù)圖4聚類樹，發(fā)現(xiàn)以相似度83%為基準(zhǔn)時，8 種不同的沙門氏菌血清型分別聚在8 個不同的分支上，其中3 株腸炎沙門氏菌，2 株鴨沙門氏菌的ERIC-PCR圖譜一致且其相似度均為100%。以相似度58%為基準(zhǔn)，可以將菌株分為A、B、C三大簇，通過Hunter等［25］提出的辛普森指數(shù)計算公式式中：N為菌株總數(shù)；S為類型總數(shù)；nj為第j類型菌株的數(shù)目）計算可得區(qū)分度指數(shù)D值為0.970 6，說明ERICPCR是不同沙門氏菌血清型的理想分型方法。

圖5　部分腸炎沙門氏菌ERIC-PCR指紋圖譜Fig.5　ERIC-PCR profiles of part of Salmonella Enteritidis isolates

隨后，按照上述優(yōu)化的循環(huán)程序，將90 株不同來源的上海腸炎沙門氏菌分離株進行ERIC-PCR擴增，部分結(jié)果如圖5所示，每株腸炎沙門氏菌分離株ERIC-PCR擴增產(chǎn)物條帶均清晰可辨，條帶均勻分布，其中最大擴增片段接近4 000 bp，最小片段100 bp，所有條帶大小在100～4 000 bp之間，每株菌的ERIC-PCR圖譜都有22 條條帶，其中大小為1 000 bp左右的條帶最亮。本研究以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13076為陽性對照菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90 株腸炎沙門氏菌分離株不論是擴增條帶數(shù)目還是條帶大小均與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13076一致，ERIC-PCR指紋圖譜并無差異，與Chmielewski等［18］的結(jié)果存在較大差異，結(jié)果表明上海市醫(yī)源性腸炎沙門氏菌分離株與食源性分離株之間，沒有差異或者是差異微小以至于ERIC-PCR指紋圖譜也難以辨別，一個可能的原因是在2008—2012年間上海地區(qū)腸炎沙門氏菌變異確實較小，以至于菌株同源性極高，另外一種可能是腸炎沙門氏菌分離株有基因組差異但是具有相同的ERIC分布及拷貝數(shù)，而ERIC-PCR不能甄別基因組其他位置上的基因差異。本研究也說明ERIC-PCR可能不適合作為高同源性菌株的理想分型方法，因此需要發(fā)掘新的分型方法，如單核苷酸多態(tài)性-PCR［26］和基于簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列與毒力基因的多態(tài)性位點序列分型方法［27］等，將成為高同源性腸炎沙門氏菌亞分型方法的未來發(fā)展方向。

3　結(jié) 論

腸炎沙門氏菌是重要的食源性致病菌，也是最主要的非傷寒沙門菌血清型之一，本研究對上海地區(qū)不同年份的腸炎沙門氏菌毒力基因攜帶情況進行了較為系統(tǒng)地探究，結(jié)果顯示腸炎沙門氏菌毒力島毒力基因invH、sopE、sugR、iacP、avrA、rhuM、prgK攜帶率達到98.0%～100.0%，毒力質(zhì)粒毒力基因spvB、spvC攜帶率達到78.0%～86.0%，毒力基因高攜帶率對人群健康存在嚴(yán)重的威脅，須加強對食品衛(wèi)生的監(jiān)督與防控。此外，還進行了ERIC-PCR分子分型研究，闡述了ERIC-PCR對沙門氏菌血清型分型的適用性，證實ERIC-PCR對不同血清型具有快速、高效分型的優(yōu)勢，同時90 株不同來源腸炎沙門氏菌也闡釋了ERIC-PCR對高同源性血清型菌株亞分型的局限性，需開發(fā)更適用于同一血清型或其他高同源性沙門氏菌菌株分型的分子分型方法，以適應(yīng)流行病學(xué)研究和風(fēng)險評估的需要。

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Screening of Virulence Genes and ERIC-PCR Sub-typing for Salmonella Enteritidis Isolates in Shanghai during 2008—2012

ZHUANG Xiaofei1， ZHOU Xiujuan1， XU Xuebin2， SHI Xianming1， SHI Chunlei1，*
（1. MOST-USDA Joint Research Center for Food Safety， Bor Luh Food Safety Center， State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Agriculture and Biology， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China；2. Center for Disease Control and Prevention of Shanghai， Shanghai 200336， China）

In this study， a total of 90 isolates of Salmonella Enteritidis， including clinical and foodborne isolates， were collected from different areas of Shanghai during 2008 to 2012. Polymerase chain reaction （PCR） was used to investigate the carrying rates of 9 common virulence genes not only in SPIs （SPI-1 and SPI-3） but also in virulence plasmid. In addition， an optimized enterobacterial repetitive intergenic consensus （ERIC）-PCR was applied to subtype these isolates. The PCR results of 90 isolates showed that the carrying rate was 100.0% for virulence genes invH， sopE and sugR， and 98.9% for iacP， avrA，prgK and rhuM， while the carrying rate of spvB and spvC was 85.6% and 78.9% respectively. Seventeen strains belonging to eight different Salmonella serovars were clearly differentiated by ERIC-PCR， with the Simpson's Diversity Index up to 0.970 6. However， the ERIC-PCR profi les of 90 Salmonella Enteritidis isolates showed no difference. In conclusion， the carrying of these virulence genes， especially sugR， invH and sopE， is very common among these isolates， demonstrating that they pose a potential threat to human health and that ERIC-PCR can be applied to the molecular classifi cation of different Salmonella serovars， but not for Salmonella Enteritidis.

Salmonella Enteritidis； virulence genes； ERIC-PCR

TS201.6

A

1002-6630（2015）14-0165-06

10.7506/spkx1002-6630-201514032

2014-10-27

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2012AA101601）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK17B10）；上海市國際合作項目（14390711900）

莊孝飛（1988—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與微生物。E-mail：zhuangxiaofeilinyi@163.com

施春雷（1977—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全與微生物。E-mail：clshi@sjtu.edu.cn