電針對PCOS模型大鼠性激素及卵巢組織 TSP-1表達的影響

余小喬　李云君

〔摘要〕 目的 探討電針對多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）模型大鼠的治療作用，以及對卵巢組織中血小板反應(yīng)蛋白-1（thrombospondin-1， TSP-1）表達的影響。方法 將32只雌性SD大鼠隨機分為空白組10只、模型組12只、電針組10只，采用1 mg/kg來曲唑加l%羧甲基纖維素灌胃建立PCOS大鼠模型。治療后檢測大鼠血清睪酮（testosterone， T）、黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone， FSH）水平，HE染色觀察卵巢組織病理結(jié)構(gòu)改變，免疫組化法檢測卵巢組織中TSP-1的表達。結(jié)果 治療后，電針組大鼠體質(zhì)量增量和卵巢相對質(zhì)量較模型組降低（P<0.01），血清T、LH水平及LH/FSH均較模型組降低（P<0.01），卵巢切片可見小囊狀擴張卵泡較模型組減少，顆粒細胞層增厚;TSP-1表達于卵巢組織顆粒細胞和卵泡膜細胞的胞漿，模型組TSP-1表達量較低空白組降低（P<0.01），電針組TSP-1表達較模型組升高（P<0.05）。結(jié)論 電針治療可改善PCOS大鼠性激素紊亂狀態(tài)，提高卵巢組織中TSP-1的表達，通過調(diào)節(jié)血管抑制因子、減少卵巢組織中血管新生、改善微循環(huán)以達到治療PCOS的目的。

〔關(guān)鍵詞〕 多囊卵巢綜合征;電針;性激素;血小板反應(yīng)蛋白-1

〔中圖分類號〕R245? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.016

Effects of Electroacupuncture on Sex Hormone and Expression of TSP-1 in

Ovarian Tissue of PCOS Rats

YU Xiaoqiao1， LI Yunjun2*

（1. Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430061， China; 2. Obstertrics and Gynecology

Department， Chinese Medicine Hospital of Hubei， Wuhan， Hubei 430061， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the therapeutic effects of electroacupuncture （EA） on polycystic ovary syndrome （PCOS） model rats and its effects on the expression of thrombospondin-1 （TSP-1） in ovarian tissues. Methods A total of 32 female SD rats were randomly divided into the blank group （n=10）， the model group （n=12）， and the EA group （n=10）. PCOS rat model was established by intragastric administration of 1 mg/kg letrozole dissolved in 1% carboxymethylcellulose （CMC）. After treatment， serum levels of testosterone （T）， luteinizing hormone （LH）， and follicle stimulating hormone （FSH） were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The pathological changes of the ovarian tissue were observed by HE staining. The expression of TSP-1 in ovarian tissues was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the model group， the body weight gain and the relative ovarian mass of the EA group were decreased when compared with the model group （P<0.01）， and the serum T， LH levels and LH/FSH were decreased when compared with the model group （P<0.01）. The HE staining of the ovarian tissue showed decreased cystic expansion follicles， and the granular cell layer was obviously thicker. TSP-1 was expressed in the cytoplasm of ovarian tissue granulosa cells and ovarian membrane cells. The expression of TSP-1 was decreased in the model group than in the blank group （P<0.01）. After treatment， the expression of TSP-1 in the EA group was increased when compared with model group （P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture can improve the state of sex hormone disorder in PCOS rats， increase the expression of TSP-1， reduce the angiogenesis in ovarian tissue by regulating angiogenesis inhibitors， and improve microcirculation to achieve the purpose of treating PCOS.

〔Keywords〕 polycystic ovary syndrome; electroacupuncture; sex hormone; thrombospondin-1

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）是一種常見的婦科疾病，主要是由神經(jīng)、內(nèi)分泌及代謝系統(tǒng)失衡引起，它以持續(xù)無排卵、卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥等為主要特征[1]。血管生成在周期性改變的排卵過程中起重要作用，卵泡發(fā)育和黃體形成都依賴于毛細血管網(wǎng)生成，而卵巢組織的血流灌注也會隨著卵泡發(fā)育和激素水平的周期性變化而改變[2]。PCOS患者卵巢間質(zhì)及卵泡囊的血管高度增生，使得卵巢表面呈結(jié)節(jié)狀突起，超聲檢查可發(fā)現(xiàn)其卵巢基質(zhì)血流增加，血管豐富且清晰，動脈血管阻力低于正常婦女[3]。針刺已被證實能夠通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸改善人體內(nèi)分泌[4]，有研究發(fā)現(xiàn)電針可通過增強梗死灶周圍血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和促血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）的表達從而促進缺血區(qū)的血管新生[5]，Tal等[6]認為PCOS的血管生成促進因子和抑制因子的動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致血管生成處于失調(diào)狀態(tài)。TSP家族是重要的血管抑制因子，血小板反應(yīng)蛋白-1（thrombospondin-1， TSP-1）在卵泡生長、黃體生成、卵巢血管生成等方面發(fā)揮著調(diào)節(jié)功能[7]。本文旨在研究PCOS大鼠卵巢組織中TSP-1的表達是否失調(diào)以及電針治療在血管生成方面的影響。

1 實驗材料

1.1? 動物

6周齡SPF級雌性SD大鼠32只，體質(zhì)量180～200 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，動物許可證號：SYXK（鄂）2015-0018。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫18～20 ℃，濕度65%～70%，自由進食飲水。本實驗過程遵守實驗動物福利倫理原則。

1.2? 試劑與藥品

來曲唑，批號LRAB3683;羧甲基纖維素，批號C-4888，均購自Sigma公司?？贵wTSP-1，批號bs-2715R，Bioss公司。睪酮（testosterone， T）試劑盒，批號E-EL-0072c;黃體生成素（luteinizing hormone， LH）試劑盒，批號E-EL-R0026c;卵泡雌激素（follicle-stimulating hormone， FSH）試劑盒，批號E-EL-R0391c，均購自伊萊瑞特公司。

1.3? 儀器

微型高速離心機，C2500-R-230V，美國Labnet;電熱恒溫培養(yǎng)箱，ICV-450，日本ASONE;全自動酶標儀，Multiskan MK3，美國熱電;病理切片機，德國

Leica RM;脫水機，俊杰JT-12J;組織攤烤片機，俊杰JK-6;抗原修復(fù)用電烤爐，SKG;顯微鏡，奧林巴斯BX53;低頻電子脈沖治療儀：G6805-2A，上海華誼牌。

2 實驗方法

2.1? 分組及造模

按隨機數(shù)字表法將大鼠分為3組：空白組、模型組、電針組，模型組12只，其余兩組各10只?？瞻捉M用l%羧甲基纖維素灌胃，其余兩組參照kafali[8]方法，用1 mg/（kg·d）來曲唑加l%羧甲基纖維素灌胃，連續(xù)灌胃30 d。

2.2? 治療方法

電針組取穴參照《實驗針灸學(xué)》[9]和《大鼠穴位圖譜》[10]定位。將大鼠置于自制鼠衣中，暴露四肢及腹部，選取后三里：直刺7 mm，左右兩側(cè);三陰交：直刺5 mm，左右兩側(cè);關(guān)元：直刺2 mm。后三里和三陰交：分別將兩側(cè)同名穴的針柄作為一組接至2個電極片上;關(guān)元：一個電極片連接關(guān)元穴針柄，另一個電極片連導(dǎo)絲纏繞于大鼠尾部中段。電針頻率為2Hz，連續(xù)波，強度以肌肉輕微抖動為度，連續(xù)20 min。每天1次，9 d為1個療程，療程間休息1 d，共3個療程。

模型組大鼠置于鼠衣中，只捆綁，不行針刺?？瞻捉M大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

2.3? 樣本收集

治療結(jié)束后，于處死前禁食8 h，空腹狀態(tài)麻醉后，手術(shù)開腹采集腹主動脈血，分離血清，置于-20 ℃保存;取出雙側(cè)卵巢，稱質(zhì)量后一側(cè)卵巢置于10%甲醛溶液中固定，另一側(cè)卵巢-80 ℃凍存?zhèn)溆?。脫水后以卵巢最大平面作為待檢平面行石蠟包埋，以4 μm厚度進行切片，制作HE染色病理片和免疫組化病理片。

2.4? 指標檢測

2.4.1? 大鼠動情周期檢測? 造模15 d后，每日上午9點對大鼠進行陰道涂片，鏡下觀察細胞形態(tài)，并判斷動情周期的變化。

2.4.2? 大鼠體質(zhì)量以及卵巢相對質(zhì)量? 取出卵巢后稱濕重，根據(jù)大鼠體質(zhì)量和卵巢重量計算卵巢相對質(zhì)量。

2.4.3? 卵巢組織病理形態(tài)? 卵巢置于10%甲醛溶液中固定，行脫水石蠟包埋后制作HE染色病理切片，于鏡下觀察卵巢組織病理形態(tài)改變。

2.4.4? 血清性激素檢測? 采集腹主動脈血并分離血清，ELISA法分別測定大鼠血清T、LH、FSH水平，嚴格按試劑盒說明書操作，測定后計算LH/FSH比值。

2.4.5? 免疫組化法檢測卵巢組織中TSP-1的表達? 鏡下觀察免疫組化病理切片中陽性細胞的表達部位。在400倍視野下，每張切片取不重疊的5個區(qū)域，定位后由攝像系統(tǒng)提取數(shù)字化細胞圖像，輸入至IPP6.0圖像分析系統(tǒng)對陽性染色區(qū)域進行光密度分析，計算平均光密度值，TSP-1表達的強弱與平均光密度值呈正相關(guān)。

2.5? 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組數(shù)據(jù)以“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），均數(shù)間兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett's T3檢驗;若不滿足正態(tài)性，則采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis H 檢驗。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 動情周期的變化和造模效果

造模20 d后，模型組和電針組陰道涂片可見大量黏液和白細胞，處于持續(xù)動情間期，失去規(guī)律的動情周期變化;空白組仍保持5～6 d規(guī)律的動情周期變化。造模30 d后，模型組大鼠較空白組體質(zhì)量明顯增加，隨機抽取2只模型組大鼠處死，解剖后行卵巢形態(tài)學(xué)檢查，卵巢體積較正常同齡大鼠增大，卵巢周圍有較多脂肪及纖維組織包裹，將卵巢組織制作病理切片，鏡下可見卵泡發(fā)育停滯，未見優(yōu)勢卵泡，大量小竇狀卵泡集聚，卵巢形成多囊樣改變，證實造模成功。見圖1。

3.2? 體質(zhì)量變化情況

與空白組相比，模型組體質(zhì)量增量、卵巢相對質(zhì)量顯著升高（P<0.01）;電針組體質(zhì)量增量、卵巢相對質(zhì)量與模型組相比顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

3.3? 血清性激素水平

與空白組相比，模型組血清T、LH含量及LH/FSH顯著升高（P<0.01）;電針組T、LH含量及LH/FSH與模型組相比降低（P<0.01）;各組FSH水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3.4? 卵巢組織學(xué)改變

HE染色后鏡下可見：空白組（圖2A）卵泡顆粒細胞呈多層，較厚，形態(tài)完整，排列整齊，卵巢內(nèi)可見優(yōu)勢卵泡;模型組（圖2B）肉眼觀色澤較蒼白，可見較多早期發(fā)育的小卵泡和閉鎖卵泡，無成熟卵泡及黃體，并出現(xiàn)多個囊狀擴張卵泡，卵泡內(nèi)卵母細胞多數(shù)消失，顆粒細胞層數(shù)減少，未見排卵跡象;電針組（圖2C）大鼠卵巢可見不同發(fā)育階段的卵泡，還可見多個黃體，且出現(xiàn)了優(yōu)勢卵泡，說明大鼠恢復(fù)了正常排卵。

3.5? TSP-1在卵巢組織中的表達

TSP-1在各組大鼠卵巢組織中均呈陽性反應(yīng)，主要表達于卵巢組織顆粒細胞和卵泡膜細胞的胞漿中?？瞻捉M有較多染色深的棕黃色顆粒，光密度分析發(fā)現(xiàn)TSP-1陽性表達較強（圖3A）;模型組中陽性細胞數(shù)明顯減少，TSP-1陽性表達明顯降低（圖3B）;電針組中TSP-1陽性表達較模型組增強（圖3C）。對免疫組化照片進行光密度分析，與空白組相比，模型組平均光密度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組相比，電針組平均光密度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

4 討論

針灸辨證是以調(diào)整陰陽的偏盛偏衰以達陰陽平衡為原則指導(dǎo)臨床[11]，PCOS患者內(nèi)分泌常表現(xiàn)為高雄、低雌激素，賀曉霞等[12]根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》中“陰陽以平為期”的宗旨，認為此病是由于陰陽失衡，女性周期節(jié)律失序而導(dǎo)致，其中腎虛肝郁證是分布較多的中醫(yī)證型[13]。大量臨床觀察[14-15]證實針刺可有效改善PCOS患者的生殖內(nèi)分泌狀態(tài)。胰島素抵抗是PCOS的病理特征之一，現(xiàn)代研究[16]認為電針可通過激活交感神經(jīng)和部分副交感神經(jīng)系統(tǒng)進而提高全身葡萄糖攝取率。宮靜等[17]研究表明針刺關(guān)元、三陰交可調(diào)整下丘腦-垂體-卵巢軸的功能，進而改善內(nèi)分泌激素水平。王君等[18]研究發(fā)現(xiàn)針刺足三里可使穴區(qū)微血管灌注量增加，改善神經(jīng)及淋巴管的血液運行，使神經(jīng)末梢興奮性提高，最終啟動神經(jīng)-內(nèi)分泌-激素網(wǎng)絡(luò)整體調(diào)節(jié)?！督疳樛鯓吠ぁ吩疲骸叭幗?，為治血之要穴”，本實驗中選取三陰經(jīng)之交會穴三陰交，疏通肝、脾、腎三經(jīng)經(jīng)氣;選取足三陰、任脈之交會穴關(guān)元，培腎固本、調(diào)理沖任，且位于腹部，可直達病所;選取足陽明之合穴足三里，調(diào)和氣血。

楊正望等[19]發(fā)現(xiàn)PCOS大鼠卵泡顆粒細胞層中雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的最后一步限速酶P450arom蛋白呈低表達。孫潔等[20]發(fā)現(xiàn)PCOS大鼠在電針作用下 P450arom表達增強，而細胞內(nèi)雄激素合成酶P450c17α表達降低，從而調(diào)節(jié)PC0S生殖內(nèi)分泌異常。林鸞[21]發(fā)現(xiàn)穴位刺激能下調(diào)促性腺激素受體LHR和FSHR mRNA的表達，改善卵巢對促性腺激素的高敏感性。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠T、LH升高，F(xiàn)SH無顯著性差異，一方面由于FSHR mRNA表達可能增高[21]，故卵巢對正常水平FSH的反應(yīng)性增高，使大量小卵泡被募集進入發(fā)育過程;另一方面由于卵泡膜細胞的LHR mRNA高表達[21]，使卵泡膜細胞對LH的反應(yīng)性增高，從而激活P450c17α的活性，合成過量的雄激素，而顆粒細胞在高水平的LH作用下，其分裂能力會顯著降低，卵泡發(fā)育停滯，導(dǎo)致無優(yōu)勢卵泡生成。電針治療降低了T、LH水平，我們認為機體內(nèi)分泌紊亂與卵巢間質(zhì)血流的變化是相關(guān)的，故推測電針通過調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)微循環(huán)，使處于紊亂狀態(tài)的因子重新分布，調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)促性腺激素受體的表達，使其發(fā)揮正常的作用。

TSP-1是重要的血管抑制因子，通過與受體CD36結(jié)合，參與顆粒細胞增殖與黃體凋亡的生理過程;還能通過抑制VEGF及其下游因子的表達來抑制血管生成。子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌患者病灶組織中TSP-1的表達減少，提示TSP-1的低表達導(dǎo)致了病灶周圍血管生成增加[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠卵巢組織中TSP-1陽性表達明顯減弱，病理切片中也發(fā)現(xiàn)卵巢間質(zhì)血管增多，證實了PCOS存在卵巢間質(zhì)微血管的增生，同時也提示了TSP-1表達降低，可能失去對某些促血管生成因子的制約，從而增加卵巢血管化。本實驗中，電針治療后TSP-1陽性表達增強，我們推測電針通過上調(diào)TSP-1的表達，抑制病變區(qū)域的血流信號，使卵巢內(nèi)紊亂的激素及相關(guān)細胞因子重新分布，進而逆轉(zhuǎn)整個病理過程，而與之相關(guān)的其它細胞因子有待進一步深入研究。

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