不同來(lái)源百合藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及分析

劉湘丹　陳勛　劉暢宇　裴剛　周日寶　王智　陳乃宏

〔摘要〕 目的 基于水分、浸出物、多糖、Regaloside A含量進(jìn)行不同來(lái)源百合藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及分析，為多基原百合藥材鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法 按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》方法測(cè)定水分、浸出物;采用紫外分光光度法測(cè)定百合多糖含量;采用高效液相色譜法測(cè)定Regaloside A含量：Supersil ODS-B（250 mm×4.6 mm， 5 μm）色譜柱，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min，流動(dòng)相0.1%磷酸水溶液∶乙腈=85∶15（V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm。結(jié)果 54批百合樣品水分均≤13%;43批百合樣品浸出物≥18%，11批百合樣品浸出物<18%;54批百合樣品多糖含量區(qū)間為9.89%～23.42%;54批百合樣品Regaloside A含量區(qū)間為0.019%～0.599%。結(jié)論 所有百合樣品水分均符合藥典要求;11批百合藥材浸出物未達(dá)到藥典要求，且均為龍牙百合藥材;17批百合多糖含量未達(dá)湖南省地方標(biāo)準(zhǔn);卷丹百合浸出物和Regaloside A含量均普遍高于市購(gòu)龍牙百合藥材。該研究為市場(chǎng)藥用百合以卷丹百合為主提供了佐證，為不同來(lái)源百合鑒別及百合藥材質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 百合;水分;浸出物;多糖;Regaloside A;含量測(cè)定;質(zhì)量評(píng)價(jià)

〔中圖分類號(hào)〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? &nbsp; ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.010

Quality Evaluation and Analysis of Lilii Bulbus from Different Sources

LIU Xiangdan1，2， CHEN Xun1， LIU Changyu1， PEI Gang1，2， ZHOU Ribao1， WANG Zhi1， CHEN Naihong1，2，3*

（1. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Traditional Chinese Medicine Piece Standardization and Function Technology Research Center， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050， China）

〔Abstract〕 Objective To evaluate and analyze the quality of Lilii Bulbus from different sources by the contents of moisture， bulbus extract， polysaccharides and Regaloside A， so as to provide the basis for identification and quality control of polybasic lilium. Methods Moisture and bulbus extract were determined according to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia. Polysaccharides was determined by ultraviolet spectrophotometry. Regaloside A was determined by high performance liquid chromatography. The column was a Supersil ODS-B column （250 mm×4.60 mm， 5 μm）. The column emperature was 30 ℃， and the injection volume was 10 μL. The flow rate was 1.0 mL/min， the mobile phase 0.1% phosphoric acid aqueous solution-acetonitrile volume ratio of 85∶15 （V/V）. The detection wavelength was at 310 nm. Results The moisture contents of 54 batches of Lilii Bulbus were all less than 13%. The bulbus extracts of 43 batches of Lilii Bulbus were greater than 18%， and the bulbus extracts of the other 11 batches of Lilii Bulbus were less than 18%. The polysaccharidse contents of 54 batches of Lilii Bulbus range from 9.89% to 23.42%. The Regaloside A content range of 54 batches of Lilii Bulbus was 0.019%～0.599%. Conclusion The moisture of 54 batches of Lilii Bulbus all meets the requirements of Chinese Pharmacopoeia. The bulbus extract of 11 batches of Lilii Bulbus were unqualified， which are all from LongYa Lilii Bulbus. The mean polysaccharide content of Lilii Bulbus from different sources was not significantly different. The bulbus extract and Regaloside A contents of Juan dan Lilii Bulbus were generally higher than those of Long Ya Lilii Bulbus on the market， which provided evidence for the fact that Juan Dan Lilii Bulbus was the main medicinal material in the market. This study can provide more references for identification and quality control of Lilii Bulbus from different sources.

〔Keywords〕 Lilii Bulbus; moisture; bulbus extract; polysaccharides; Regaloside A; content determination; quality evaluation

百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其應(yīng)用歷史悠久，屬藥食同源品種。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）記載百合來(lái)源于百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium brownii F.E. Brown var. viridulum Baker或細(xì)葉百合Lilium pumilum DC.的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]。其味甘性寒，歸心、肺經(jīng)，有養(yǎng)陰潤(rùn)肺，寧心安神的功效，主要用于治療肺虛久咳，勞嗽咳血，心煩失眠，情緒不能自主等病[1]。

研究表明，藥用百合鱗葉中主要含有多糖、酚酸甘油酯、甾體皂苷、甾醇、黃酮、苯丙素、多糖類、生物堿及磷脂、無(wú)機(jī)鹽等成分。其中百合多糖含量高，具抗腫瘤、降血脂、抗病毒、抗突變和提高細(xì)胞免疫活性等多種生理功能[2-5]，為百合主要功能成分之一;酚酸甘油酯亦為百合大類成分，具抗氧化、抗腫瘤、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)及雌激素活性等生理功能[6-8]，其中Regaloside A為百合酚酸甘油酯類成分之一[9]，項(xiàng)目組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在百合藥材中相對(duì)百分含量較高，且具有顯著的抗抑郁藥理活性，具有潛在研究?jī)r(jià)值。

筆者收集百合藥材樣品過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，藥用百合品種主要為卷丹Lilium lancifolium Thunb.和百合

Lilium brownii F.E. Brown var. viridulum Baker兩種，其中卷丹以藥用為主（其干燥肉質(zhì)鱗葉商品習(xí)稱卷丹百合），百合可藥食兩用（其干燥肉質(zhì)鱗葉商品習(xí)稱龍牙百合），湖南為以上兩品種主產(chǎn)區(qū)，主為栽培，秋季采收;細(xì)葉百合Lilium pumilum DC.的干燥肉質(zhì)鱗葉市場(chǎng)基本不見(jiàn)流通。市場(chǎng)調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，食用百合主流品種除龍牙百合外還有蘭州百合Lilium davidi var. unicdor cotton干燥肉質(zhì)鱗葉（商品習(xí)稱蘭州百合），其次市場(chǎng)還存非藥用品種如金百合（其飲片性狀與卷丹百合相似）入藥現(xiàn)象，百合為多基原藥材，市場(chǎng)存在品種難以區(qū)分或混用現(xiàn)象。

基于此，本研究在2015版《中國(guó)藥典》百合藥材性狀鑒別及水溶性浸出物含量基礎(chǔ)上，增加百合大類成分多糖、Regaloside A兩個(gè)指標(biāo)，對(duì)收集的藥用百合品種、食用主流品種、藥用混淆品及野生百合樣品的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析，以期為鑒定不同來(lái)源百合、行百合藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1? 主要儀器

超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;Waters 1525 高效液相色譜儀（配有2489紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器，二元泵）（美國(guó)沃特世公司）;ME204E/02電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;中草藥粉碎機(jī)（天津市泰式特儀器有限公司），UV-1750紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）;TDZ-5-A離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;UV1800PC紫外分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）。

1.2? 主要材料

無(wú)水葡萄糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)63005518）;Regaloside A對(duì)照品（實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98%）;甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）;磷酸（長(zhǎng)沙分路口塑料化工廠，分析純）;乙腈（德國(guó)默克股份有限公司，色譜純）;硫酸（湖南匯虹試劑有限公式，分析純）;乙醇（安徽安特食品股份有限公司，分析純）;蒽酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

項(xiàng)目組于2017-2018年度共收集54批百合樣品（包括藥用百合、食用百合、百合藥材混偽品、野生百合），經(jīng)湖南省藥品檢驗(yàn)研究院方石林教授、湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張志國(guó)教授、湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授、劉塔斯教授、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)謝紅旗教授鑒定為百合科相關(guān)品種，具體信息見(jiàn)表1。其中野生百合，為筆者野外采集，于實(shí)驗(yàn)室自加工用于對(duì)照。

2 方法與結(jié)果

2.1? 水分

按照2015版《中國(guó)藥典》第四部通則0832第二法（烘干法）對(duì)54批百合樣品水分進(jìn)行測(cè)定分析，54批百合樣品水分含量均在13%及以下，符合藥典規(guī)定。

2.2? 浸出物

按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》第四部通則2201水溶性浸出物冷浸法，對(duì)54批百合樣品進(jìn)行浸出物測(cè)定，以干燥品計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。其中S1-S21卷丹百合樣品浸出物均大于18%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn);S22-S47市購(gòu)百合中有11個(gè)樣品浸出物小于18%，未達(dá)藥典標(biāo)準(zhǔn);S48-S50浸出物均較高，達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn);所測(cè)的細(xì)葉百合、蘭州百合及百合混用品金百合浸出物達(dá)到藥典要求，但因收集樣品少實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅做參考對(duì)照。

2.3? 多糖含量測(cè)定

2.3.1? 對(duì)照品溶液的制備? 精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品50.014 mg，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備? 精密量取對(duì)照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分別置棕色具塞試管中，分別加0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL，混勻，迅速置冰水浴中冷卻后，置沸水浴中加熱10 min，取出，置冰水浴中放置5 min，室溫放置10 min，以相應(yīng)試劑為空白，在580 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度（C）為縱坐標(biāo)，吸光度（A）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為

C=0.034 9 A+0.000 6（r=0.999 5）。

2.3.3? 測(cè)定方法? 取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加水100 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，精密量取上清液1.5 mL，加乙醇7.5 mL，搖勻，離心，取沉淀加水溶解，置50 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，照“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。

2.3.4? 樣品含量測(cè)定? 取54批不同來(lái)源的百合藥材，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.3.2”項(xiàng)方法測(cè)定吸光度值，代入線性回歸方程，計(jì)算多糖含量。本品按干燥品計(jì)算，含百合多糖以無(wú)水葡萄糖（C6H12O6）計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知54批樣品多糖含量區(qū)間為9.89%～23.92%，樣品間含量差異大。

2.4? Regaloside A含量測(cè)定

2.4.1? 色譜條件與系統(tǒng)適用性? 色譜柱：Supersil ODS-B柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）;流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液∶乙腈=85∶15（V/V）;流速：1 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣體積：10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)按Regaloside A峰計(jì)算不低于3 500，樣品中Regaloside A與其他峰能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，保留時(shí)間在9.8 min左右。相關(guān)色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4.2? 對(duì)照品溶液的制備? 精密稱取Regaloside A對(duì)照品7.5 mg，置于25 mL容量瓶中，用75%甲醇溶解并稀釋至刻度，制得濃度為0.3 mg/mL的Regaloside A對(duì)照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，密封，低溫避光保存，備用。

2.4.3? 供試品溶液的制備? 精密稱?。ㄟ^(guò)四號(hào)篩）百合樣品粉末3 g置帶塞錐形瓶中，加入75%甲醇溶液60 mL，稱重，靜置2 h后，室溫超聲30 min，待冷卻用75%甲醇補(bǔ)重，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，制得供試品溶液。

2.4.4? 線性關(guān)系考察? 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下制得的對(duì)照品溶液，加75%甲醇制成濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。精密吸取10 μL上述各濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣并按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄Regaloside A峰面積。以Regaloside A峰面積（A）為縱坐標(biāo)，Regaloside A的質(zhì)量濃度（C，mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程

A=29 135 433.236 5C-35 293.602 6 （r=0.999 8）

結(jié)果表明，Regaloside A質(zhì)量濃度在0.01～0.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5? 精密度試驗(yàn)? 精密稱取S23號(hào)樣品粉末3 g，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次并記錄Regaloside A峰面積。計(jì)算Regaloside A峰面積的RSD為0.67%（n=6），表明所用儀器精密度良好。

2.4.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 精密稱取S23號(hào)樣品粉末3 g，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別于制備后的1、4、6、8、10、24 h按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，并記錄Regaloside A的峰面積。結(jié)果Regaloside A峰面積的RSD為1.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7? 重復(fù)性試驗(yàn)? 精密稱取6份S23號(hào)樣品粉末3 g，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行高效液相測(cè)定并記錄Regaloside A峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.28%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.8? 加樣回收率試驗(yàn)? 分別精密稱取6份S23號(hào)樣品各1.5 g于錐形瓶中，加入57.2 mL 75%的甲醇和2.8 mL“2.4.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，稱重，靜置2 h，超聲30 min，補(bǔ)重，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)樣測(cè)定，記錄Regaloside A峰面積，計(jì)算回收率為（101.87±1.25）%（n=6）。

2.4.9? 樣品含量測(cè)定? 取54批不同來(lái)源的百合藥材，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行峰面積測(cè)定，代入線性回歸方程，計(jì)算Regaloside A含量，54批百合樣品Regaloside A含量區(qū)間為0.019%～0.599%，樣品間含量差異較大。結(jié)果見(jiàn)表3。3 討論

本研究主要進(jìn)行卷丹百合與市購(gòu)龍牙百合質(zhì)量評(píng)價(jià)和分析，其它來(lái)源百合因樣本量少僅做參考對(duì)照。

3.1? 由表2可知，21批卷丹百合浸出物含量范圍為20.63%～45.09%，平均含量為25.76%;26批市購(gòu)龍牙百合浸出物含量范圍為14.64%～23.89%，其中11個(gè)樣未達(dá)藥典標(biāo)準(zhǔn)，其平均百分含量為18.47%，卷丹百合浸出物明顯高于市購(gòu)龍牙百合浸出物;5～6月采野生百合和5月份采栽培龍牙百合浸出物高于市購(gòu)龍牙百合浸出物。所有百合樣品中僅37批百合樣品多糖含量≥15%，達(dá)湖南龍山百合地方標(biāo)準(zhǔn)（多糖含量≥15%）[10]，其中21批卷丹百合多糖含量范圍為11.45%～23.42%，平均含量為15.99%，26批市購(gòu)龍牙百合多糖含量范圍為10.16%～21.69%，平均含量為16.16%。

3.2? 本試驗(yàn)建立的Regaloside A含量HPLC測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于百合藥材中該成分的含量測(cè)定。不同來(lái)源百合中Regaloside

A含量存在差異：21批卷丹百合Regaloside A含量范圍為0.161%～0.347%，均值為0.233%;26批市購(gòu)龍牙百合Regaloside A含量范圍為0.036%～0.144%，均值為0.078%; 5月份采基地龍牙百合Regaloside A含量為0.253%;野生百合Regaloside A含量范圍為0.203%～0.599%，均值為0.401%;細(xì)葉百合Regaloside A含量較低，為0.056%;蘭州百合Regaloside A平均含量低，為0.043%;金百合Regaloside A含量低，為0.058%。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，卷丹百合浸出物、Regaloside A含量均顯著高于市購(gòu)龍牙百合，其為市場(chǎng)中藥百合以卷丹百合為主提供了佐證;5月份采基地龍牙百合及野生百合浸出物、Regaloside A含量均顯著高于市購(gòu)龍牙百合，提示百合栽培技術(shù)和采收期可能還有一定的研究空間，卷丹百合、龍牙百合、細(xì)葉百合、蘭州百合可通過(guò)飲片形狀、性味進(jìn)行鑒別區(qū)分，金百合與卷丹百合性狀相似常為市場(chǎng)藥用百合混用品，因其Regaloside A含量較卷丹百合明顯低，因此可通過(guò)測(cè)定Regaloside A含量與卷丹百合區(qū)分鑒別。

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