特異性引物GSP對玉米絲黑穗病苗的檢測效率

常保增

在對玉米進行某種病原檢測中，通常使用的是 PCR 檢測技術. PCR 技術用來檢測病原物是指選擇某一特定的引物去擴增相應的目的 DNA片段. 該實驗所采用的引物是由上海生工生物公司合成的玉米絲黑穗病菌的特異性引物（GSP），然后采用 PCR 擴增檢測技術可以對玉米病苗中的絲黑穗病菌基因組進行特異性的擴增，對擴增的樣品 DNA 進行濃度為1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，最后在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察和記錄，從而得知玉米是否感染了絲黑穗病. 最后計算出該特異性引物 GSP 對玉米病苗的檢測效率，看是否可以用于快速有效的對玉米感病植株在發(fā)病之前對病菌進行檢測.

1 材料與方法

1. 1 材料準備

（1）絲黑穗冬孢子的觀察

稱取 10 mg 已經(jīng)處理好的玉米絲黑穗病菌冬孢子粉，將其置于 1. 5 mL 的離心管中，加入適量的無菌水浸泡過夜，然后置于高速離心機中離心 2 min（10000 r/min），棄掉上清液. 再用無菌水處理 1 d，再次離心并棄掉上清液. 將已經(jīng)處理好的冬孢子沉淀浸泡于配置好的 2% 葡萄糖溶液中，置于 28 ℃的溫箱中黑暗培養(yǎng)3 d，3 d 后觀察冬孢子的萌發(fā)狀態(tài).

（2）試驗材料及病菌

玉米感病品種（黃早 4），植物 DNA 提取試劑盒（寶生物公司購買），供試絲黑穗病菌（將事先收集好的病菌樣品置于室內(nèi)晾干，再用篩子充分篩選出孢子粉，將孢子粉置于通風、陰涼、干燥處保存?zhèn)溆茫?

（3）配置菌土

土壤采樣后放入高壓滅菌鍋中進行滅菌，待土壤冷卻后加入玉米絲黑穗菌粉配置成 1% 的菌土.

（4）播種與接種

選取 200 粒感病品種黃早 4，將種子在 4 月20 日播種于吉林省農(nóng)業(yè)科學院所屬的玉米試驗田（公主嶺），每穴 2 ～3 粒，將配置好的菌土覆蓋在玉米種子上.

（5）取樣

在玉米抽穗前期（此時病狀并未表現(xiàn)出來）對玉米的根與葉片組織進行采樣.

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA 的提取方法（采用試劑盒提取，提取方法參照說明書）

將采集的每份玉米根與葉片的樣品取適量置于研缽中用液氮充分的研磨，將研磨好的樣品組織（不多于 50 mg）分裝于 1. 5 mL 的離心管中，并分別做好標記. 加入400μL LE Buffer，上下顛倒混合均勻，迅速置于 65℃ 環(huán)境中溫浴 15 ～30 min（期間可震蕩離心管 2 - 3 次），然后移出.

1. 2. 2 DNA 純度的檢測

隨機抽取已提取的樣品 DNA 進行電泳檢測，每個隨機樣品取 5μL 于 1. 5% 的瓊脂糖凝膠中進 行 電 泳，電 流 180mA，電 壓 180V，電 泳15min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察 DNA 的降解情況及是否有 RNA 的影響.

PCR 檢測：

（1）所使用的引物購買于上海生工生物公司，引物 GSP 的序列為上游 5’- TCGCCGACGGATGATAATCG -3’下游 5’- GAGTCACCCGCCCAAAGTTA - 3’

（2）反應程序：共設置 35 個循環(huán)，步驟如下：94 ℃（預變性）4 min→94℃（變性）1 min→54℃（復性）1 min→72 ℃（延伸）1. 5 min→72 ℃（延伸）5 min→4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?/p>

（3）1. 5%瓊脂糖凝膠電泳用萬分之一天平稱取適量的瓊脂糖，加入適量的已配置好的 TAE 溶液配制成 1. 5% 凝膠，用微波爐將其沸騰一次后加入適量的 EB，趁熱倒入插好梳子的制膠槽中，待凝膠凝固后加入 PCR的產(chǎn)物，10 μL 的樣品，并加入 DNA Marker.

（4）電泳的結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察和記錄.

2、結(jié)果與分析

2. 1 玉米絲黑穗冬孢子萌發(fā)情況的觀察從溫箱中取出已培養(yǎng) 3 d 的玉米絲黑穗冬孢子，吸取適量的冬孢子滴于載玻片的中央，并滴幾滴無菌水后蓋上蓋玻片，至于電子顯微鏡下觀察其萌發(fā)狀態(tài). 結(jié)果如下.冬孢子萌發(fā)前的狀態(tài)，在將其至于 2%的葡萄糖溶液中，28℃黑暗培養(yǎng) 3 d 后，其萌發(fā)狀態(tài). 說明該絲黑穗冬孢子粉具有活性且能正常萌發(fā)，可以使用其對玉米進行侵染.

2. 2 DNA 的提取與檢測

將采用試劑盒方法提取的 DNA 樣品，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，用試劑盒所提取的樣本組織的 DNA 可以獲得高質(zhì)量的 DNA，可以用于后續(xù)的實驗.

2. 3 PCR 結(jié)果檢測

2. 3. 1 玉米葉片組織中絲黑穗病原菌的檢測為帶病玉米植株葉片組織 DNA的電泳結(jié)果，其中 M 是 DNA Marker，1 ～10，13 ～22 均為黃早 4 未發(fā)病葉片組織 DNA，11、23 均為水（CK），12、24 均為玉米絲黑穗病菌的 DNA. 根據(jù)圖 4 可知，以玉米葉片 DNA 為模板進行病菌PCR 檢測發(fā)現(xiàn)只擴增出了 3 條與玉米絲黑穗病菌在同一范圍內(nèi)的譜帶，其中 5 號較為明顯，14號、21 號均不明顯，病菌的檢測效率僅為 15%.

2. 3. 2 以玉米根組織中絲黑穗病原菌的檢測為帶病玉米植株根組織 DNA 的電泳結(jié)果，其中 M 是 DNA Marker，1 ～10，13 ～22均為黃早 4 未發(fā)病根組織 DNA，11、23 為水（對照），12、24 為玉米絲黑穗病菌的 DNA. 以玉米葉片 DNA 為模板進行病菌 PCR 檢測發(fā)現(xiàn)擴增出了 16 條與玉米絲黑穗病菌在同一范圍內(nèi)的譜帶，僅有 2 號、3 號、5 號沒有擴增出譜帶，13 號不太明顯，病菌的檢測效率為 80%.

在對玉米絲黑穗病進行 PCR 研究時，通常提取的是玉米下部組織的 DNA 而不采用玉米葉片組織的 DNA. 通過查閱相關的文獻發(fā)現(xiàn)，玉米絲黑穗病屬于幼苗期侵染的一種系統(tǒng)性的病害，絲黑穗的病原菌以散落在土壤中、混入到糞肥中或附著在玉米種子表面的冬孢子越冬，第二年成為主要的傳染源，其中以土壤帶菌侵染為主.病原菌于種子萌發(fā)開始從根莖、胚芽以及芽鞘侵染，并且在植株體內(nèi)形成菌絲，跟隨著植物向上生長. 因此，在玉米植株的下部組織 DNA 中的病原菌濃度要遠遠大于上部組織 DNA 中的病原菌濃度，而葉片中的病原菌數(shù)量要低于莖髓組織和根部組織甚至是沒有，因為病原菌菌絲是選擇性的對植株的部位進行侵染的，若選擇侵染葉片則不利于病原菌的繁殖.

參考文獻

[1] ?李玥瑩，董雪卉，許麗，等. 玉米抗絲黑穗病基因 RAPD 分析[J]. 生物技術，2006（5）：16 -18.

[2] ?邢躍先，吳鳳新，蔡鑫茹，等. 葉片 DNA 對玉米絲黑穗病研究的可靠性[J]. 玉米科學，2008（6）：114 -116.

[3] ?晉齊名. 東北地區(qū)玉米、大豆重要病蟲害識別與防治. 吉林：吉林科學技術出版社