膀胱癌組織中細胞周期檢測點激酶2的表達及其意義

井崗山 張哲

[摘要]目的?探討細胞周期檢測點激酶2（CHK2）在膀胱癌組織中表達及臨床意義。方法?分別采用實時熒光定量PCR技術和免疫組織化學法，檢測73例膀胱癌及癌旁組織中CHK2基因和蛋白的表達情況。結果?膀胱癌組織中CHK2 mRNA相對表達量低于癌旁組織，膀胱癌組織中CHK2蛋白陽性表達率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（t=24.146，χ2=49.936，P<0.05）;膀胱癌組織中CHK2 mRNA相對表達量和CHK2蛋白陽性表達均與pT分期、淋巴結轉移和P53蛋白表達有關（t=2.347～9.217，χ2=4.171～33.400，P<0.05）;CHK2蛋白陰性表達組病人平均生存時間47.25個月，CHK2蛋白陽性表達組病人平均生存時間67.24個月，Log-Rank檢驗差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.269，P<0.05）。結論?CHK2在膀胱癌組織中呈低表達，且與病人預后有關。

[關鍵詞]膀胱腫瘤;細胞周期檢測點激酶2;病理學，臨床

[中圖分類號]R737.14;R365

[文獻標志碼]A

[文章編號]?2096-5532（2019）05-0510-04

doi：10.11712/jms201905002

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，由于膀胱癌多呈浸潤性生長，術后具有較高的復發(fā)率[1]，嚴重威脅人類的健康。研究表明，細胞周期異常在腫瘤發(fā)生、進展和轉移中發(fā)揮重要作用[2]。細胞周期檢測點激酶2（CHK2）是調控細胞周期的主要激酶之一，與細胞周期穩(wěn)定、DNA修復、基因組平衡等密切相關[3-5]。CHK2參與了多種惡性腫瘤發(fā)生及進展過程[6]。實驗研究結果顯示，RPA介導的膀胱癌TSGH-8301細胞生長抑制與CHK2激活相關[7]。但CHK2與膀胱癌臨床病理特征及病人預后間的關系鮮有報道。本研究對膀胱癌組織中CHK2基因及蛋白表達進行檢測，探討其與臨床病理特征之間的相關性及對預后的影響?，F(xiàn)將結果報告如下。

1?資料與方法

1.1?一般資料

2010年3月-2012年3月，我院收治的膀胱癌病人73例，術前均未行放化療，術后經病理活檢證實為原發(fā)性尿路上皮性癌。73例病人，男性62例，女性11例;年齡28～81歲，平均年齡（61.7±11.4）歲。均于術中留取膀胱癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣>2 cm），組織標本分兩份，其中1份用40 g/L甲醛溶液固定，石蠟包埋;另1份快速置于液氮中，保存于-70 ℃冰箱以備檢。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有病人均知情同意。

1.2?方法

1.2.1?實時熒光定量PCR技術檢測膀胱癌及癌旁組織中CHK2基因表達?分別取膀胱癌及癌旁組織，研磨，用Trizol總RNA提取試劑盒（購自美國Gibco公司）提取組織細胞中總RNA。利用紫外線分光光度計檢測總RNA純度和濃度，以A260/A2801.80～2.20作為合格。用逆轉錄試劑盒（購自大連寶生物公司）逆轉錄，用PCR試劑盒（購自日本TaKaRa公司）進行擴增。引物種類及其序列見表1。PCR反應條件：94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，72 ℃、6 min，連續(xù)進行36次循環(huán)。每個樣品均設3個平行反應復孔。用2-△△Ct法計算膀胱癌及癌旁組織中CHK2基因相對表達量。

1.2.2?免疫組化染色檢測膀胱癌及癌旁組織中CHK2蛋白表達?取石蠟包埋組織標本，切片，常規(guī)脫蠟、水化，進行抗原修復，用體積分數(shù)為0.03的過氧化氫溶液封閉，山羊血清封閉25 min。加入一抗兔抗人CHK2多克隆抗體（購自武漢博士德公司，稀釋比例1∶200），4 ℃下過夜孵育。加入二抗，室溫下孵育60 min，加入DAB，蘇木精復染，脫水、封片，觀察。用雙盲法分別由兩位具有副高級以上職稱醫(yī)師觀察，按照文獻的方法[8]判定結果。①染色范圍：0分，無染色;1分，陽性染色細胞比例<25%;2分，陽性染色細胞比例26%～50%;3分，陽性染色細胞比例51%～75%;4分，陽性染色細胞比例>75%。②染色強度：0分，無著色;1分，染色淺黃色;2分，染色黃色或棕色;3分，染色棕褐色。③染色指數(shù)：?、?②之和，0級，≤2分;1級，3～4分;2級，5～6分;3級，7分。根據染色指數(shù)對結果進行判定：陰性，0級或1級;陽性，2級或3級。

1.2.3?病例隨訪?所有病人均進行隨訪，隨訪形式包括門診和電話，隨訪截止日期2017年3月31日，隨訪過程中未出現(xiàn)失訪病例。

1.3?統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件完成數(shù)據整理和分析。計量資料采用[AKx-D]±s表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier法，生存曲線比較采用Log-Rank檢驗。以P<0.05為差異有顯著意義。

2?結果

2.1?膀胱癌及癌旁組織CHK2基因和蛋白表達的比較

膀胱癌組織中CHK2 mRNA相對表達量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（t=24.146，P<0.05）。膀胱癌組織中CHK2蛋白的陽性表達率低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=49.93，P<0.05）。見表2和圖1。

2.2?膀胱癌組織CHK2基因和蛋白表達與臨床病理特征之間的關系

膀胱癌組織中CHK2 mRNA的相對表達量和CHK2蛋白陽性表達均與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量和分級無關（t=0.239～1.182，χ2=0.066～1.003，P>0.05），而與pT分期、淋巴結轉移和P53蛋白的表達有關（t=2.347～9.217，χ2=4.171～33.400，P<0.05）。見表3。

2.3?膀胱癌組織中CHK2蛋白表達對病人預后的影響

本文73例膀胱癌病人中，截至2017年3月31日，最短生存時間5個月，最長84個月。CHK2蛋白陰性表達組病人的平均生存時間為47.25個月，而陽性表達組病人的平均生存時間為67.24個月，Log-Rank檢驗顯示差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.269，P<0.05）。見圖2。

3?討論

膀胱癌作為一種男性高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病過程較為復雜，涉及多因素、多步驟[9-11]，其中，細胞周期調控異常在腫瘤發(fā)生、進展中發(fā)揮關鍵性作用[12-14]。CHK2是一種細胞周期檢查點激酶，在DNA損傷誘導的細胞周期阻滯、細胞凋亡、染色體組裝及穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[15-17]。有研究表明，CHK2表達異常會影響細胞周期及細胞修復而導致癌變風險增加[18-20]。CHK2在腫瘤發(fā)生中的作用尚存在爭議，CHK2在乳癌[21]、肺癌[22]、結直腸癌[23]等惡性腫瘤中表達缺失，可能發(fā)揮抑癌基因的作用;但CHK2在胃癌、食管癌、肝癌等惡性腫瘤中表達上調[24-26]，可能發(fā)揮癌基因的作用。本研究顯示，CHK2在膀胱癌組織中呈低表達，提示CHK2可能在膀胱癌發(fā)生中發(fā)揮抑制作用。

本研究結果顯示，CHK2 mRNA相對表達量和CHK2蛋白陽性表達在pT分期T2～T4期、發(fā)生淋巴結轉移、P53蛋白陽性的膀胱癌組織中呈低表達，進一步說明CHK2低表達可促進膀胱癌進展，提示CHK2可能充當抑制腫瘤發(fā)生的角色而參與膀胱癌發(fā)生、進展過程。有研究指出，抑癌基因p53是DNA損傷反應中CHK2關鍵性作用靶點，CHK2在保證p53穩(wěn)定及積累中發(fā)揮重要作用[27]。p53是一種抑癌基因，但經免疫組化檢測到的均為突變型p53，因此與文獻[27]不同，突變型p53對CHK2有負反饋調節(jié)作用[28]。本研究顯示P53蛋白陽性表達的膀胱癌組織中CHK2呈低表達，也從另一個方面說明CHK2高表達對維持P53蛋白穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，CHK2蛋白陰性表達組病人平均生存時間短于陽性表達組，表明CHK2蛋白表達與膀胱癌病人預后有關，CHK2高表達可能預示著病人預后較好。

綜上所述，CHK2在膀胱癌組織中呈低表達，可能由于其發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用而參與膀胱癌發(fā)生、進展過程，且與病人預后相關，有望為膀胱癌診療提供新的靶位和思路。

[參考文獻]

[1]MASSON-LECOMTE A， RAVA M， REAL F X， ?et al. Inflammatory biomarkers and bladder cancer prognosis： a systematic review[J]. European Urology， 2014，66（6）：1078-1091.

[2]ABREU VELEZ A M， HOWARD M S. Tumor-suppressorgenes， cell cycle regulatory checkpoints， and the skin[J]. North American Journal of Medical Sciences， 2015，7（5）：176-188.

[3]ZANNINI L， DELIA D， BUSCEMI G. CHK2 kinase in the DNA damage response and beyond[J]. Journal of Molecular Cell Biology， 2014，6（6）：442-457.

[4]羅媚，肖玲，馬安迪，等. CHK2在腫瘤中作用的研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 2018，18（6）：1193-1196.

[5]譚亞麗，夏紅，曾穎，等. 沉默Chk2基因對DADS阻滯人胃癌BGC823細胞G2/M期的影響[J]. 中南醫(yī)學科學雜志， 2018，46（6）：603-607.

[6]牛朝霞，陳潔，王黎，等. 細胞周期檢測點激酶1/2在相關腫瘤診斷治療中的研究進展[J]. 河南大學學報（醫(yī)學版）， 2018，37（1）：73-76.

[7]OU T T， WU C H， HSU J D， ?et al. Paeonia lactiflora Pall inhibits bladder cancer growth involving phosphorylation of Chk2 in vitro and in vivo[J]. J Ethnopharmacol， 2011，135（1）：162-172.

[9]AMIR S， MABJEESH N J. microRNA expression profiles as decision-making biomarkers in the management of bladder cancer[J]. Histol Histopathol， 2017，32（2）：107-119.

[10]譚益帆，劉修恒，王磊，等. BRD4抑制劑JQ1對膀胱癌細胞增殖與凋亡的作用及其機制研究[J]. 現(xiàn)代泌尿外科雜志， 2018，23（4）：293-298.

[11]HAMEED D A， YASSA H A， AGBAN M N， ?et al. Genetic aberrations of the K-ras proto-oncogene in bladder cancer in relation to pesticide exposure[J]. Environ Sci Pollut Res Int， 2018，25（22）：21535-21542.

[12]XU Xilong， XIONG Xiufang， SUN Yi. The role of ribosomal proteins in the regulation of cell proliferation， tumorigenesis， and genomic integrity[J]. Science China （Life Sciences）， 2016，59（7）：656-672.

[13]WU P， LIU S， SU J， ?et al. Apoptosis triggered by isoquercitrin in bladder cancer cells by activating the AMPK-activated protein kinase pathway[J]. Food Funct， 2017，8（10）：3707-3722.

[14]秦曉平，詹雄宇，陳奇彪，等. 小檗堿增強絲裂霉素C誘導的膀胱癌T24細胞周期阻滯及凋亡[J]. 中國病理生理雜志， 2018，34（6）：1025-1030.

[15]ZAHMATKESH M H， HOSSEINIMEHR S J， MAHDIUNI H. Role of CHK2 inhibitors in the cellular responses to ionizing radiation[J]. Mini Reviews in Medicinal Chemistry， 2014，14（10）：812-818.

[16]梁曉奔，林柏鍵，郎軍添. ATM-CHK2信號通路調控頭頸鱗狀細胞癌研究進展[J]. 國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2018，42（3）：136-139.

[17]HAYAKAWA K， HIRATA H， SAMSONOV M， ?et al. Planar compression of extracellular substrates induces S phase arrest via ATM-independent CHK2 activation[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2018，506（4）：983-989.

[18]MATT S， HOFMANN T G. The DNA damage-induced cell death response： a roadmap to kill cancer cells[J]. Cellular and Molecular Life Sciences： CMLS， 2016，73（15）：2829-2850.

[19]常方圓，杜曉玲，戴弘季，等. 惡性外周神經鞘膜瘤中TBX2基因突變及相關蛋白表達的臨床意義[J]. 中國腫瘤臨床， 2017，44（1）：29-35.

[20]RONCO C， MARTIN A R， DEMANGE L， ?et al. ATM， ATR， CHK1， CHK2 and WEE1 inhibitors in cancer and can-

cer stem cells[J]. Medchemcomm， 2016，8（2）：295-319.

[21]黃波，談順. ATM、Chk2、p53和Rad51的表達與乳腺癌的相關性研究進展[J]. 海南醫(yī)學， 2015，26（21）：3187-3190.

[22]YUAN Zhu， GUO Wenhao， YANG Jun， ?et al. PNAS-4， an early DNA damage response gene， induces S phase arrest and apoptosis by activating checkpoint kinases in lung cancer cells[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2015，290（24）：14927-14944.

[23]ERTYCH N， STOLZ A， STENZINGER A， ?et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells[J]. Nature Cell Biology， 2014，16（8）：779-791.

[24]CARDOSO P C D S， ROCHA C A M D， LEAL M F， ?et al. Effect of diterpenoid kaurenoic acid on genotoxicity and cell cycle progression in gastric cancer cell lines[J]. Biomed Pharmacother， 2017，89（3）：772-780.

[25]LI Baozhong， CHEN Zhaoli， SHI Susheng， ?et al. Overexpression of Cdc25C predicts response to radiotherapy and survival in esophageal squamous cell carcinoma patients treated with radiotherapy followed by surgery[J]. Chinese Journal of Can-cer， 2013，32（7）：403-409.

[26]NIKOLAISHVILLI-FEINBERG N， COHEN S M， MIDKIFF B， ?et al. Development of DNA damage response signaling biomarkers using automated， quantitative image analysis[J]. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry， 2014，62（3）：185-196.

[27]CHOO D W， GOH S H， CHO Y W， ?et al. CHK2 is involved in the p53-independent radiosensitizing effects of valproic acid[J]. Oncology Letters， 2017，13（4）：2591-2598.

[28]LUO Q， GUO H， KUANG P， ?et al. Sodium fluoride arrests renal G2/M phase cell-cycle progression by activating ATM-Chk2-P53/Cdc25C signaling pathway in mice[J]. Cell Physiol Biochem， 2018，51（5）：2421-2433.

（本文編輯?牛兆山?于國藝）