乳清蛋白ACE抑制肽酶解工藝純化研究

[摘要]為充分利用奶酪制作的副產(chǎn)物——乳清蛋白增加乳制品附加值，本研究以濃縮乳清蛋白為試驗(yàn)原料，采用酶解技術(shù)制備乳清蛋白ACE（Angiotensin Converting Enzyme）抑制肽。在酶的篩選試驗(yàn)中，以酶解產(chǎn)物ACE抑制率和肽得率為指標(biāo)選出最佳水解用酶為Alcalase 2.4L堿性蛋白酶，然后采用單因素試驗(yàn)得到了此酶的最佳水解條件并對(duì)水解物的穩(wěn)定性進(jìn)行了試驗(yàn)。研究結(jié)果表明，最適酶解條件為底物濃度7.5%、加酶量6 000U/g、pH值8.5、溫度55℃，得到酶解產(chǎn)物ACE抑制率為69.38%、IC50為0.80mg/mL，經(jīng)模擬腸胃消化處理后，肽的活性并無顯著變化，穩(wěn)定性較好。經(jīng)葡聚糖凝膠純化后，抑制率提升至75.33%，其IC50為0.74mg/mL。

[關(guān)鍵詞]乳清蛋白;ACE抑制肽;酶解;純化

中圖分類號(hào)：Q512+.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190517

牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)資源，已有研究表明，可將這些蛋白質(zhì)水解為活性肽，而且其中一些肽段已被證明具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌等活性功能，大大提高了牛奶的利用價(jià)值[1-5]。本研究以生產(chǎn)干酪副產(chǎn)物——乳清蛋白為原料，制備ACE抑制肽，并對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用超濾分級(jí)、葡聚糖凝膠層析對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行純化，制備出高活性乳清蛋白ACE抑制肽。

1? 材料與設(shè)備

1.1? 原料與試劑

主要原料與試劑見表1，其余試劑為分析純。

1.2? 儀器與設(shè)備

主要設(shè)備與儀器見表2。

2? 試驗(yàn)方法

2.1? ACE抑制活性的測定

首先制備0.1 mol/L的硼酸鹽緩沖液，pH值為8.3，將HHL溶于其中，配置濃度為5 mmol/L。取100 μL配置好的HHL溶液，加入25 μL的ACE抑制劑，用電動(dòng)混勻器充分混勻，放置在37 ℃水浴鍋中水浴5 min后，加入l5 μL的ACE，混勻，再放置37 ℃下溫育40 min。結(jié)束后加入120 μL、1 mol/L的HCl終止反應(yīng)。再加入1.2 mL乙酸乙酯，用混勻器混合20 s，用來萃取生成HA（馬尿酸）。然后離心10 min，轉(zhuǎn)速為1 200 r/min，靜止后從中吸取0.9 mL上層溶液，滴入試管中，放入100 ℃的烘箱烘干，烘干后取出試管，加入3 mL去離子水溶解，混勻器混勻后于228 nm下測定吸光值[6-7]。抑制率計(jì)算式：

ACE抑制率=[（對(duì)照組-樣品組）÷（對(duì)照組-空白組）]×100%? ? ? ? ? ?（1）

抑制率達(dá)到50%時(shí)的抑制劑濃度為半抑制濃度，記為IC50。

2.2? 肽得率的測定

肽得率以氮溶指數(shù)（TCA-NSI）表示，將等體積的水解液與15%三氯乙酸（TCA）混合均勻，靜置20 min后離心15 min，轉(zhuǎn)速為1200 r/min，采用微量凱氏定氮法測定上清液中蛋白質(zhì)的含量[8]。肽得率計(jì)算公式：

肽得率=（N÷N0）×100%? ? ? ?（2）

式中：N為經(jīng)TCA處理后上清液中的總氮;N0為未經(jīng)TCA處理的水解液中的總氮。

2.3? 乳清蛋白ACE抑制肽水解用酶的篩選

首先要對(duì)蛋白酶進(jìn)行篩選，根據(jù)龔琴等[9-10]的研究，篩選最適條件下的胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，加酶量為5 000 U/g，底物濃度為5%。以ACE抑制率和肽得率為指標(biāo)，經(jīng)比較分析得出最適宜水解乳清蛋白的蛋白酶。

稱取一定量的乳清蛋白，加入去離子水配置成所需濃度，沸水預(yù)煮10 min使蛋白質(zhì)中的酶失活，再降溫至酶解所需溫度，調(diào)節(jié)后加入蛋白酶。在酶解過程中，要用堿式滴定管不斷滴入NaOH使pH值維持在最適范圍之內(nèi)，當(dāng)pH值不再變化時(shí)，水解完畢。將水解液在沸水浴中不斷攪拌15～20 min，使酶失活，然后以1 200 r/min離心分離15 min，取上清液經(jīng)冷凍干燥制得ACE抑制肽。

2.4? 酶解工藝單因素試驗(yàn)

酶解工藝單因素試驗(yàn)水平梯度見表3。

3? 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1? 最佳水解用酶的確定

不同蛋白酶對(duì)ACE抑制率影響見圖1。據(jù)圖1可知，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后的ACE抑制率效果較好，其中Alcalase 2.4L堿性蛋白酶在水解2 h后抑制率最高為53%，木瓜蛋白酶最大ACE抑制率也可達(dá)到48%，但水解時(shí)間較長，為4h，效率較低。在達(dá)到最大ACE抑制率后，隨著水解時(shí)間延長，ACE抑制活性均有所降低，這可能是由于產(chǎn)生了對(duì)具有ACE活性的基作用有影響的水解產(chǎn)物，從而導(dǎo)致ACE抑制率下降。

不同蛋白酶對(duì)肽得率的影響見圖2。據(jù)圖2可知，隨著水解時(shí)間增加，5種蛋白酶的肽得率均呈不斷上升趨勢，最后趨于平穩(wěn)，其中堿性蛋白酶肽得率最大能達(dá)到42%。當(dāng)水解時(shí)間足夠長時(shí)，水解程度不再增加。根據(jù)ACE抑制率和肽得率兩項(xiàng)指標(biāo)可以得出堿性蛋白酶為最佳水解用酶。以下試驗(yàn)用酶均為Alcalase 2.4L堿性蛋白酶。

3.2? pH值對(duì)乳清蛋白肽ACE抑制率和肽得率的影響

不同pH值對(duì)乳清蛋白肽ACE抑制率和肽得率的影響見圖3。

據(jù)圖3可知，隨著pH值的升高，肽得率和ACE抑制率有明顯增大，當(dāng)pH值達(dá)到8.5時(shí)，肽得率達(dá)到最大，為34%，此時(shí)ACE抑制率也達(dá)到最大，為65%。當(dāng)水解堿性環(huán)境繼續(xù)增強(qiáng)，肽得率和ACE抑制率呈下降趨勢。由此得出，Alcalase 2.4L堿性蛋白酶最適水解pH值為8.5。

3.3? 加酶量對(duì)乳清蛋白肽ACE抑制率和肽得率的影響

不同加酶量對(duì)乳清蛋白肽ACE抑制率和肽得率的影響見圖4。據(jù)圖4可知，反應(yīng)初期，肽得率和抑制率均隨著加酶量的增加而增大，反應(yīng)的速度也逐漸增快，但加酶過多會(huì)使水解程度過大，這可能是破壞了肽鏈的活性基團(tuán)，造成活性下降。因此，加酶量6 000 U/g較為合適。

3.4? 溫度對(duì)ACE抑制率和肽得率的影響

ACE抑制率和肽得率受試驗(yàn)溫度的影響程度見圖5。據(jù)圖5可知，隨著溫度升高，55 ℃之前，兩項(xiàng)指標(biāo)逐漸上升;升高到55 ℃以上后，指標(biāo)均下降，且相對(duì)同步。經(jīng)過分析，可能的原因是溫度促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，相關(guān)官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，酶解效率不斷受到影響，導(dǎo)致活性下降。由此可得出，55 ℃可視為最佳試驗(yàn)溫度。

3.5? 底物濃度對(duì)ACE抑制率和肽得率的影響

ACE抑制率和肽得率受底物濃度的影響程度見圖6。據(jù)圖6可知，底物濃度升高能夠促使反應(yīng)更好進(jìn)行，濃度達(dá)到一定程度后，反應(yīng)體系的流動(dòng)性大幅下降，蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速率變慢，底物與酶的接觸不夠活躍，呈現(xiàn)出反應(yīng)被抑制趨勢。由此可得出，7.5%為最佳底物濃度。

由5項(xiàng)單因素試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，制備乳清蛋白ACE抑制肽最適合的水解酶是堿性蛋白酶，水解條件可確定為酶添加量6 000 U/g、pH值8.5、溫度55 ℃、底物濃度7.5%。以上條件下，ACE抑制率為69.38%，IC50為0.80 mg/mL。

4? ACE抑制肽體外模擬消化穩(wěn)定性試驗(yàn)

4.1? 試驗(yàn)方法

4.1.1? 模擬人體胃液試驗(yàn)

配置胃液：取稀鹽酸1.6 mL，分別加80 mL水、胃蛋白酶1 g，混合均勻后，用水稀釋到100 mL。

取固體肽產(chǎn)品40 mg，取12 mL胃液進(jìn)行溶解，在37 ℃條件下水浴3.5 h，沸水滅酶15 min，在10 000 r/min條件下，離心分離15 min，取上清液進(jìn)行ACE抑制活性檢測。

4.1.2? 模擬人體腸液試驗(yàn)

配置腸液：取磷酸二氫鉀0.68 g，加100 mL水溶解，取0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加入胰蛋白酶10 g，混合均勻后，稀釋至1 000 mL。

重復(fù)模擬人體胃液試驗(yàn)。

4.2? ACE抑制肽體外模擬消化對(duì)活性的影響

ACE抑制肽體外模擬消化對(duì)活性的影響見圖7。

據(jù)圖7可知，ACE抑制肽由胃、腸兩種消化液分別處理后，抑制活性下降不大[11-14]。

5? ACE抑制肽的純化

選取分離分子量為5 000 U、3 000 U和1 000 U的超濾膜開展分離試驗(yàn)，可以獲得4種不同分子量的成分，分別是分子量大于5 000 U的肽I、分子量在3 000～5 000 U的肽Ⅱ、分子量在1 000～3 000 U的肽Ⅲ、分子量小于1 000 U的肽Ⅳ。逐一測定4種不同分子量區(qū)間肽的活性。

5.1? 分子量不同的肽段與活性的關(guān)系

不同分子量肽段與活性的相關(guān)性見圖8。

據(jù)圖8可知，分子量在1 000～3 000 U的肽段是抑制最明顯的組分，能達(dá)到75%，IC50為0.85 mg/mL?？梢赃x擇此組分進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

5.2? 葡聚糖凝膠層析法分離ACE抑制肽

采用葡聚糖凝膠層析法分離ACE抑制肽，不同類別的葡聚糖凝膠分離范圍見表4。

由表4可看出，純化1 000～3 000 U的組分，選擇葡聚糖凝膠G-15最為合適。層析分離結(jié)果見圖9，圖中的3個(gè)吸收峰，其中58～60 min的吸收峰分離效果最好。多次重復(fù)試驗(yàn)后，將3個(gè)吸收峰對(duì)應(yīng)組分收集，冷凍干燥后測定活性，得出結(jié)論為峰2（81.3%）>峰3（52.6%）>峰1（43.6%），目標(biāo)成分在峰2對(duì)應(yīng)的肽段中，測定IC50為0.74 mg/mL。

6? 結(jié)? 論

通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，確定了乳清蛋白ACE抑制肽的最佳用酶是堿性蛋白酶，對(duì)應(yīng)最適水解條件：加酶量6 000 U/g、pH值為8.5、溫度55 ℃、底物濃度7.5%，得到的多肽抑制率為69.38%，IC50為0.80 mg/mL，模擬體外消化得到乳清蛋白ACE抑制肽能夠保持消化穩(wěn)定性，經(jīng)葡聚糖凝膠純化后，抑制率提升至75.33%，其IC50為0.74 mg/mL。

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收稿日期：2019-04-16

作者簡介：劉靜，女，本科，助理工程師，研究方向?yàn)榘l(fā)酵技術(shù)工藝優(yōu)化、新產(chǎn)品研發(fā)、食品科學(xué)及成果推廣。