藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織最適培養(yǎng)基的研究

陶興魁 高貴珍 張興桃

摘要：目的：為了篩選藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基，借助藍莓試管苗無性繁殖的優(yōu)點使其快速繁殖.方法：利用藍莓葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的生成，選擇不同種類的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及不同濃度組合的植物生長調(diào)節(jié)劑設(shè)計正交實驗以找出最適宜藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基.結(jié)果和結(jié)論：WPM1/2基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，NAA對藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織影響最大，藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為WPM1/2+0.5mg·L-1 ZT+1.0mg·L-1 IAA+0.15mg·L-1 NAA.

關(guān)鍵詞：藍莓葉片;愈傷組織;正交試驗;培養(yǎng)基

中圖分類號：S663.9? 文獻標(biāo)識碼：A? 文章編號：1673-260X（2019）06-0032-04

藍莓（blueberry）又被稱為越橘或藍漿果，藍莓是“漿果之王”，它的果皮相對較薄，有著自己獨特的風(fēng)味以及豐富的營養(yǎng)成分，味道酸甜[1].藍莓的果實中存在較多的營養(yǎng)組分，被國際糧農(nóng)組織列為五大健康食品之一[2-3].藍莓被譽為“黃金漿果”在我國具有很好的市場發(fā)展前景[4-5].藍莓常規(guī)繁殖速度較慢，且病毒感染嚴重，品種容易退化[6-7]，利用組織培養(yǎng)則繁殖速度較快，且能保持品種特性[8].國內(nèi)外對于藍莓組培研究，多集中對藍莓莖段或芽、莖尖等外植體誘導(dǎo)植株再生的研究[9-12]，但是較少的研究涉及以藍莓葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的研究.在本實驗中，采用藍莓的葉片作為外植體，在試驗中采用單因素實驗對MS培養(yǎng)基、改良MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、WPM1/2培養(yǎng)基、1/2WPM培養(yǎng)基進行篩選.然后利用ZT、NAA、IA三種激素之間的不同濃度組合來設(shè)計正交試驗，研究藍莓葉片誘導(dǎo)的愈傷組織的最適培養(yǎng)條件.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

苗圃園藍莓幼嫩葉片.

1.1.2 試劑材料

IAA、NAA、ZT、瓊脂、蔗糖、消毒劑等.

1.1.3 實驗場所及儀器

組培室、無菌操作臺、紫外燈、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、稱量紙、皮筋、封口膜、三角燒瓶（500ml）、量筒（500ml、1000ml）、燒杯（500ml、1000ml）、長鑷子、記號筆、培養(yǎng)皿、酒精燈、恒溫水浴鍋、玻璃棒等.

1.2 方法

1.2.1 外植體的選擇和滅菌

幼嫩葉片，用清水浸泡，溫度控制在20℃～25℃，用自來水沖洗3h，剪取1.0～1.5cm見方的塊，用清水反復(fù)沖洗，然后在超凈工作臺上用75%酒精溶液處理30s，無菌水沖洗數(shù)次，再用1%升汞溶液浸泡5min，用無菌水沖洗5～6次，沖洗速度先快后慢.

1.2.2 培養(yǎng)基的篩選

分別以MS培養(yǎng)基、改良的MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、1/2WPM培養(yǎng)基（WPM中大量元素減半）、WPM1/2培養(yǎng)基（WPM中各組分減半）為基本培養(yǎng)基，添加1.0mg·L-1IAA，0.5mg·L-1ZT篩選適合葉片誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基.

1.2.3 葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

以正交實驗因素水平表為依據(jù)，采用L9（33）正交表配制9種培養(yǎng)基，葉片剪成1.0～1.5厘米見方的塊，在無菌條件下接種于培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶種4～5個，重復(fù)3次，經(jīng)過30d培養(yǎng)統(tǒng)計出愈率，觀察愈傷組織的長勢.

1.2.4 實驗結(jié)果評定指標(biāo)

出愈率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體的總數(shù)×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

2.1.1 結(jié)果

將適量處理好的葉片接種到MS、改良的MS、WPM、1/2WPM、WPM1/2五種培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時間后，部分葉片出現(xiàn)卷曲、邊緣開始出現(xiàn)一些白色的小顆粒，愈傷組織開始生成（圖1-2），30d后統(tǒng)計結(jié)果并記錄.

通過對表3的分析可知，培養(yǎng)基有利于藍莓葉片愈傷組織的程度由大到小的順序是WPM1/2>改良MS>WPM>1/2WPM>MS，這表明WPM1/2最適宜葉片誘導(dǎo)愈傷組織的生成.

2.2 不同濃度配比的植物生長劑對藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

2.2.1 結(jié)果

在WPM1/2基本培養(yǎng)基中加入不同濃度的ZT、NAA、IAA植物生長劑，在接種20d后同樣也會發(fā)生葉片邊沿卷起，葉片邊緣開始出現(xiàn)少量白色的小顆粒（圖3-6），30d后統(tǒng)計出愈率.

通過對表4的極差分析，極差R值越大表示該因素的影響也較大，所以對藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響大小為NAA>IAA>ZT，這說明NAA對于出愈率的影響最大.可以看出當(dāng)NAA濃度增大時，出愈率也會隨之增加.表中K值越大說明這個水平較高，由表4可以得出，ZT的均值K1>K2>K3，IAA的均值K2>K3>K1，NAA的均值K3>K2>K1，正交實驗是較為均一的實驗，只是全部實驗中一部分，所以在表中未被表現(xiàn)出來，通過實驗分析說明最優(yōu)的處理組合為A1B2C3.同時通過圖3、圖4、圖5、圖6看出，藍莓葉片誘導(dǎo)的愈傷組織在生長過程中會出現(xiàn)由淺綠色變褐色的現(xiàn)象，并且愈傷組織的疏松程度也不同，有的葉片生成的愈傷組織較密，然而有的葉片生成的愈傷組織較為疏松.

正交試驗是一種均一性設(shè)計試驗，不可能包含全部處理組合，因此A1B2C3在實驗中就沒有顯現(xiàn)出來.為驗證A1B2C3是最優(yōu)組合，配制此種培養(yǎng)基20瓶進行驗證試驗.表5表明，AA1B2C3組合愈傷組織出愈率達到93.3%，明顯高于正交表中的9種培養(yǎng)基，進一步對比分析圖片（圖7、圖8）可以發(fā)現(xiàn)，兩張圖片中的愈傷組織顏色不相同，圖7中的葉片為綠色，并且較為疏松，而圖8中的愈傷組織為淺黃色，并且較為密集，長勢明顯較好.這說明A1B2C3組合的培養(yǎng)基確實比5號培養(yǎng)基更適合藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織生長，這也就是證實了藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適的處理實驗組合為WPM1/2+0.5 mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.15mg·L-1NAA.

為了能夠更準(zhǔn)確分析植物生長劑對藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響，因此也進行了方差分析，結(jié)果表明NAA具有顯著性，說明NAA對于藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響最大，此結(jié)果和極差分析中的結(jié)果相符.

3 結(jié)論和討論

通過實驗探究表明藍莓組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基、改良MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、WPM1/2培養(yǎng)基、1/2WPM培養(yǎng)基均能使藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織，從實驗數(shù)據(jù)分析得出WPM1/2培養(yǎng)基的效果最好.實驗采用NAA生長素、IAA生長素、ZT分裂素之間的組合，結(jié)果得到NAA對于藍莓葉片誘導(dǎo)愈傷組織影響最大，并且隨著NAA濃度的增大，出愈率也隨之增大.對于藍莓葉片誘導(dǎo)的愈傷組織的適合培養(yǎng)條件為WPM1/2+0.5mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.15mg·L-1NAA.在實驗中還發(fā)現(xiàn)藍莓愈傷組織在未接種到分化培養(yǎng)基之前，經(jīng)過一段時間的生長后會出現(xiàn)不同的變化，即有的愈傷組織由綠色變?yōu)楹稚?，有的愈傷組織由白色變?yōu)榈S色，且愈傷組織較為密集.

本實驗中也存在一些的不足，一方面在實驗中會出現(xiàn)一定的葉片污染，因此在以后的實驗中要更加注意實驗過程中的滅菌;另一方面，在實驗中發(fā)現(xiàn)藍莓愈傷組織出現(xiàn)了不同程度的褐化現(xiàn)象，可能是植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度或者彼此之間濃度配比不同所導(dǎo)致，這些問題在以后的實驗中有待進一步研究.

參考文獻：

〔1〕劉歡.”漿果之王”藍莓的營養(yǎng)保健作用研究[J].中國新技術(shù)新產(chǎn)品，2009（19）：228.

〔2〕劉慶忠，趙紅軍，鄭亞芹，等.高灌藍莓微體繁殖技術(shù)研究初報[J].落葉果樹，2011（5）：1-3.

〔3〕楊紅澎.藍莓活性成分、吸收代謝及其神經(jīng)保護作用研究進展[J].衛(wèi)生研究，2010（4）：525-528.

〔4〕程磊，郭偉，陳勝榮，等.藍莓組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2017（12）：87-90.

〔5〕梁文衛(wèi)，宋鵬慧，閻聰，等.美登藍莓試管苗瓶內(nèi)快速生根試驗[J].中國果樹，2015（4）：44-47.

〔6〕茨韋特科夫·約旦，趙燕麗，王春，等.引進國外藍莓品種的組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（6）：24-26.

〔7〕嚴家駒，黃作喜，李強.藍莓繁殖技術(shù)的研究進展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2018，24（14）：43-46+120.

〔8〕熊翠林.兔眼藍莓組培苗瓶內(nèi)生根技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2018，24（6）：46-48.

〔9〕王連潤，馬鈞，胡忠榮，等.藍莓離體快速繁殖研究[J].紅河學(xué)院學(xué)報，2009（10）：17-18.

〔10〕周歷萍，王淑珍，來文國.藍莓組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].杭州農(nóng)業(yè)與科技，2011（3）：30-31.

〔11〕王淑珍，來文國.南高叢藍莓組培再生技術(shù)研究[J].現(xiàn)代農(nóng)林科技，2011（21）：30-31.

〔12〕黃科，黃琴，代歡，等.藍莓離體快繁及生根特點研究[J].經(jīng)濟林研究，2016，34（1）：140-146.