基于不同Caspase凋亡通路的玄參環(huán)烯醚萜總苷抑制心肌梗死模型大鼠心肌細胞凋亡的作用機制研究

梁儉 駱杰爐 蔡慶群 許良葵 李脈 黃海潮

中圖分類號 R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）06-0735-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.06.04

摘 要 目的：研究玄參環(huán)烯醚萜總苷抑制心肌梗死模型大鼠心肌細胞凋亡的作用機制。方法：將雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和玄參環(huán)烯醚萜總苷低、中、高劑量給藥組，每組10只。采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法建立心肌梗死模型，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。各劑量藥物組大鼠在造模成功后分別灌胃玄參環(huán)烯醚萜總苷混懸液，每次劑量為50、100、200 mg/kg（以總苷提取物質(zhì)量計），灌胃體積為10 mL/次，每天2次，連續(xù)給藥7 d；假手術(shù)組和模型組大鼠同法灌胃等體積生理鹽水。記錄大鼠術(shù)前、術(shù)后及給藥7 d過程中的Ⅱ?qū)?lián)心電圖S-T段變化情況；檢查大鼠心功能指標(biāo)；采用比色法、免疫抑制法或酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組大鼠血清中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、N末端鈉尿肽原（NT-pro BNP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；采用TUNEL法觀察心肌細胞凋亡情況；采用比色法檢測心肌細胞中超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）的含量；采用ELISA法、酶解比色法或酶解熒光法檢測心肌細胞中Bcl-2、Bax、細胞色素C（Cyt C）、胱天蛋白酶8（Caspase-8）、Caspase-9、Caspase-12、Caspase-3、Calpain的蛋白表達水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心電圖S-T段顯著抬高，左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑均顯著增加，左室射血分數(shù)、短軸縮短率均顯著降低；血清中LDH、CK-MB、cTnⅠ、NT-pro BNP、TNF-α水平均顯著升高；心肌組織中有大量黃褐色凋亡細胞；心肌組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高；心肌細胞中Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值均顯著降低，Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Calpain的蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各劑量藥物組大鼠的上述指標(biāo)及心肌組織病理學(xué)變化均有顯著改善；心肌細胞中Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值均顯著升高，Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Calpain的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：玄參環(huán)烯醚萜苷可同時通過抑制Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12相關(guān)的3條凋亡通路，繼而抑制Caspase-3的激活，從而起到抗心肌細胞凋亡作用。

關(guān)鍵詞 玄參；環(huán)烯醚萜總苷；心肌梗死；半胱天冬蛋白酶；凋亡途徑；機制；大鼠

Study on the Effect Mechanism of Iridoid Glycosides of Scrophularia ningpoensis Inhibiting Cardiomyocytes Apoptosis in Myocardial Infarction Model Rats Based on Different Caspase Apoptosis Pathways

LIANG Jian1，LUO Jielu1，CAI Qingqun1，XU Liangkui2，LI Mai2，HUANG Haichao2（1. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China； 2. Experimental Training Center， Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou 510520， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effect mechanism of iridoid glycosides extracted from Scrophularia ningpoensis inhibiting cardiomyocytes apoptosis in myocardial infarction model rats. METHODS： The male Wistar rats were randomly divided into sham operation group， model group and S. ningpoensis iridoid glycosides low-dose， medium-dose and high-dose groups， with 10 rats in each group. Myocardial infarction models were established by ligating the left anterior descending coronary artery of the rats， and sham operation group was only threaded without ligation. After the model was established， each administration group was given S. ningpoensis iridoid glycosides suspension intragastrically at three different doses of 50，100，200 mg/kg （by the amount of total glycosides extract） with 10 mL/time， twice a day， for consecutive 7 days. Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically with same method. The changes of S-T segment of lead ECG Ⅱ were recorded before， after and during 7 days of administration. Cardiac function of rats was examined. The serum levels of LDH， CK-MB， cTnⅠ， NT-pro BNP and TNF-α were determined by colorimetry， immunosuppression or ELISA. The apoptosis of myocardial cells was observed by TUNEL method. SOD activity and MDA content in cardiac myocytes were detected by colorimetry. The expressions of Bcl-2， Bax， Cyt C， Caspase-8， Caspase-9， Caspase-12， Caspase-3 and Calpain in cardiac myocytes were detected by ELISA， enzymolysis colorimetry or enzymatic fluorescence assay. RESULTS： Compared with sham operation， electrocardiogram S-T segment was significantly elevated and the left ventricular end-diastolic diameter and left ventricular end-systolic diameter were significantly increased in the model group； left ventricular ejection fraction and short axis shortening rate decreased significantly； serum levels of LDH， CK-MB， cTnⅠ， NT-pro BNP and TNF-α were increased significantly； there were a large number of yellow-brown apoptotic cells in myocardial tissue； the activity of SOD in myocardial tissue was significantly decreased while the content of MDA was significantly increased； the protein expression level of Bcl-2 and Bcl-2/Bax were significantly decreased， while the levels of Bax， Cyt C， Caspase-3， Caspase-8， Caspase-9， Caspase-12 and Calpain were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above indexes and pathological changes of myocardial tissue were improved significantly in administration group； the level of Bcl-2 and Bcl-2/Bax in cardiomyocytes increased significantly， while the levels of Bax， Cyt C， Caspase-3， Caspase-8， Caspase-9， Caspase-12 and Calpain decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： S. ningpoensis iridoid glycosides can inhibit the activation of Caspase-3 by inhibiting three apoptotic pathways related to Caspase-8， Caspase-9 and Caspase-12， and then inhibit the apoptosis of cardiomyocytes.

KEYWORDS Scrophularia ningpoensis； Iridoid glycosides； Myocardial infarction； Caspase；Apoptosis pathway； Mechanism； Rat

玄參是玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的支根經(jīng)烘曬干燥而制成的藥材，傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認為其味甘、苦、咸，性微寒，具有滋陰涼血、解毒散結(jié)、行氣通脈之功效[1]。因此，玄參常作為治療心血管疾病中成藥（如復(fù)方血栓通膠囊、健心顆粒沖劑、脈絡(luò)寧注射液等）的主要組方藥材，在臨床上常用以治療陰虛血瘀型冠心病[2]?，F(xiàn)代中藥學(xué)研究表明，玄參主要含環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、苯丙素苷類、三萜皂苷類等成分，其中環(huán)烯醚萜苷類化合物在玄參中含量較高，是其最主要的藥效成分[3]。研究證實，環(huán)烯醚萜苷具有擴張冠狀動脈、清除氧自由基、減輕炎癥反應(yīng)、抑制血栓形成等作用[4]。

心肌梗死是在冠狀動脈發(fā)生狹窄病變的基礎(chǔ)上繼發(fā)形成血栓，從而引起急性供血短缺，導(dǎo)致心功能衰竭、心肌缺氧壞死的疾病[5]。而在心肌缺血的過程中，側(cè)支循環(huán)再灌注產(chǎn)生的氧自由基和組織壞死引發(fā)的炎癥反應(yīng)，也是造成心肌組織損傷的重要因素[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死的病理變化與細胞的程序性死亡（即凋亡）密切相關(guān)，心肌細胞凋亡可能是心肌組織發(fā)生不可逆損傷的一個重要因素[7]。胱天蛋白酶（Caspases）家族是啟動細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，根據(jù)起始激活Caspase種類的不同，細胞凋亡途徑可分為Caspase-8啟動的外源性途徑、Caspase-9啟動的內(nèi)源性途徑、Caspase-12（鼠類）啟動的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，分別涉及炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙等導(dǎo)致心肌凋亡的關(guān)鍵因素[8]。已有學(xué)者通過檢測Caspase-3的活性來研究玄參提取物抑制氧化應(yīng)激所致心肌凋亡的作用機制[9]。然而Caspase-3是細胞執(zhí)行上述3種凋亡途徑的匯合點，僅對其進行研究無法充分說明玄參提取物是通過抑制哪一條途徑來發(fā)揮抗凋亡作用。目前，仍未見有研究從Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12相關(guān)的3條凋亡通路整體深入探討玄參環(huán)烯醚萜總苷抑制心肌凋亡的作用機制[10]。為此，本課題組通過建立大鼠心肌梗死模型，進一步闡明玄參環(huán)烯醚萜總苷抑制缺血性心肌細胞凋亡的作用及其機制，為更深入研究玄參的藥效成分提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MS304S型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-1000DE-Q型超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；SAV2500型動物呼吸機、V3404型動物心電監(jiān)護儀（美國SurgiVet公司）；CX23型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Acuson SC2000型超聲顯像儀（德國Siemens公司）；Synergy 2型全自動多功能酶標(biāo)儀（美國Diotek公司）；AU5800型生化分析儀（美國Beckman公司）；Elecsys2010型免疫分析儀[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]；Sorvall ST40型臺式離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Direct-Q3型超純水儀（美國 Millipore公司）。

1.2 試劑

乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、N末端鈉尿肽原（NT-pro BNP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；Bcl-2、Bax、細胞色素C（Cyt C）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、鈣蛋白酶（Calpain）活性檢測試劑盒（美國Biovision公司）；硫化鈉、水合氯醛、蘇木精（上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司）；HPD100大孔吸附樹脂（16～60目，天津浩聚樹脂科技有限公司）；其余試劑為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 藥材

玄參飲片（廣東康美藥業(yè)中藥飲片廠，批號：180306231），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院主任中藥師蔡慶群作顯微和理化鑒別，鑒定為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）干燥支根。

1.4 動物

SPF級Wistar雄性大鼠50只，6周齡，體質(zhì)量為（196±5.2）g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0001。

2 方法

2.1 玄參環(huán)烯醚萜總苷的提取

稱取充分粉粹的玄參粉末500 g，參照文獻[11]，按液料比20 ∶ 1（L/g）加入30%乙醇，超聲提?。üβ剩?00 W，頻率：40 kHz）30 min×3次，合并提取液，抽濾，得濾液。稱取預(yù)處理過的HPD100大孔樹脂適量，裝柱，根據(jù)文獻[12]，將上述濾液酸堿度調(diào)節(jié)pH至4，按10倍柱體積（BV）上樣，靜態(tài)吸附48 h后，按6 BV以pH 8的80%乙醇洗脫。取洗脫液，在70 ℃條件下旋蒸濃縮，50 ℃恒溫干燥揮發(fā)殘余溶劑，得棕褐色粉末，即玄參環(huán)烯醚萜總苷提取物（約27.82 g，得率約為5.56%），置于干燥器中在室溫下保存，備用。

2.2 大鼠心肌梗死模型的建立

參照文獻[13]建立大鼠心肌梗死模型。對大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，將其仰臥固定于操作臺上，用8%硫化鈉溶液脫去胸前雜毛，氣管插管，采用動物呼吸機通氣并記錄術(shù)前肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。皮膚消毒后剪開胸骨，以10號線荷包穿縫；剝離肋間肌肉，于第3～4肋間鈍性開胸，使心臟充分暴露；于左心耳根部下方2 mm處進針，穿過表層于肺動脈圓錐旁出針，找到左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈后，于左心耳下2～3 mm處用6～0號無損傷縫合線結(jié)扎（寬度為0.2～0.3 cm）；將心臟沿肋間間隙放回胸腔，迅速擠出胸腔內(nèi)氣體并拉緊荷包縫合線縫合切口。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎，其余同法處理。術(shù)后測定Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以心電圖S-T 段明顯抬高為心肌梗死模型成功建立的標(biāo)志。術(shù)后大鼠肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。

2.3 分組與給藥

取造模成功的大鼠40只，隨機分為模型組和低、中、高劑量藥物組，每組10只；另取10只假手術(shù)組大鼠作為對照。各劑量藥物組分別灌胃“2.1”項下總苷提取物的水制混懸液，每次劑量為50、100、200 mg/kg（劑量按人體用量換算而得[14-15]，以玄參環(huán)烯醚萜總苷提取物質(zhì)量計），灌胃體積為10 mL/次，每天2次，連續(xù)給藥7 d；假手術(shù)組和模型組大鼠同法灌胃等體積生理鹽水。

2.4 大鼠心電圖S-T段變化情況監(jiān)測

在術(shù)前、術(shù)后及給藥7 d過程中，各組大鼠按“2.2”項下方法麻醉、固定后，記錄各時間點的Ⅱ?qū)?lián)心電圖的S-T段變化。

2.5 大鼠心功能指標(biāo)檢測

末次給藥后第2天，各組大鼠按“2.2”項下方法麻醉、固定，采用超聲顯像儀取胸骨旁左室長軸切面檢測各項心功能指標(biāo)，主要包括左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVEDs）；同時，計算左室射血分數(shù)（LVEF）和短軸縮短率（LVFS），LVEF≈（LVEDd3-LVEDs3）/LVEDd3×100%，LVFS=（LVEDd-LVEDs）/LVEDd×100%。

2.6 大鼠血清標(biāo)志物水平檢測

取“2.5”項下麻醉大鼠，清潔其尾部污垢后，剪去尾尖 2～3 mm，向下輕輕擠壓尾根收集血液1 mL至離心管中，靜置30 min，3 000 r /min離心5 min。吸取上層血清500 μL，按相應(yīng)試劑盒說明書操作，采用比色法檢測血清中LDH水平，采用免疫抑制法檢測CK-MB水平，采用ELISA法檢測cTnⅠ、NT-pro BNP、TNF-α水平。上述指標(biāo)均以自動生化分析儀進行檢測。

2.7 大鼠心肌細胞凋亡情況觀察

采用原位末端凋亡檢測（TUNEL）法進行染色觀察。取“2.5”項下麻醉大鼠，沿劍突剪開其胸骨并暴露胸腔，迅速取出心臟并排出腔內(nèi)血液，剪取部分心臟組織置于4%多聚甲醛溶液中固定約4 h，常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋、切片（5 μm）。按相應(yīng)試劑盒說明書操作，以辣根過氧化酶（HRP）催化底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）生成深棕色沉淀物，再經(jīng)蘇木精復(fù)染細胞核后，于顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)及染色情況。深棕色沉淀物越多、顏色越深，則表示心肌細胞凋亡數(shù)越多。

2.8 大鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測

取“2.7”項下剪取的另一部分心臟組織，于4 ℃預(yù)冷的培養(yǎng)皿內(nèi)將其剪碎，稱取約100 mg，在冰浴條件下制成勻漿，于4 ℃條件下以3 000 r /min離心10 min。吸取上清液，按相應(yīng)檢測試劑盒說明書操作，采用比色法以酶標(biāo)儀檢測SOD的活性和MDA的含量。

2.9 大鼠心肌組織中Caspase凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平檢測

取“2.8”項下心肌勻漿上清液，微孔濾膜過濾，采用BCA法進行總蛋白定量并確定后續(xù)操作的上樣量。按相應(yīng)試劑盒說明書操作，分別采用ELISA法以免疫分析儀檢測Bcl-2、Bax、Cyt C表達水平；采用酶解比色法以多功能酶標(biāo)儀檢測Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Caspase-3表達水平；采用酶解熒光法以多功能酶標(biāo)儀檢測Calpain表達水平[以相對熒光強度（RFI）表示]。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示。模型組與假手術(shù)組比較采用t檢驗分析，各劑量給藥組與模型組兩兩多重比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心電圖S-T段變化

與假手術(shù)組比較，造模成功的大鼠心電圖S-T段在不同時間點均顯著抬高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，各劑量藥物組大鼠心電圖S-T段隨實驗時間的延長而呈下降趨勢；在給藥第5、6、7天時，各劑量藥物組大鼠心電圖S-T段均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01），且這一下降趨勢隨給藥劑量的增加而更明顯。各組大鼠心電圖S-T段變化見圖1。

3.2 各組大鼠心功能指標(biāo)水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的LVEDd和LVEDs均顯著增加，LVEF和LVFS均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各劑量藥物組大鼠的LVEDd和LVEDs均顯著降低，LVEF和LVFS均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠的心功能指標(biāo)水平檢測結(jié)果見表1。

3.3 各組大鼠血清標(biāo)志物水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中LDH、CK-MB、cTnⅠ、NT-pro BNP、TNF-α水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，各劑量藥物組上述血清標(biāo)志物水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血清標(biāo)志物水平檢測結(jié)果見表2。

3.4 各組大鼠心肌組織凋亡情況

鏡下可見，假手術(shù)組大鼠心肌組織細胞排列緊密、橫紋清晰，細胞核未見棕色沉淀物；模型組大鼠心肌組織細胞排列不規(guī)整、肌束變性分離，心肌間質(zhì)有較多炎性細胞浸潤，大量細胞核附著有深棕色沉淀物；各劑量藥物組大鼠心肌組織細胞的形態(tài)病變程度、細胞核深棕色沉淀物、炎癥細胞浸潤均較模型組減少。各組大鼠心肌組織凋亡情況顯微圖見圖2。

3.5 各組大鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，各劑量藥物組大鼠心肌細胞中SOD活性均顯著升高，MDA含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測結(jié)果見表3。

3.6 各組大鼠心肌組織中Caspase凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值均顯著降低，Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Calpain的蛋白表達水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，各劑量給藥組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值均顯著升高，Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Calpain的蛋白表達水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠心肌組織中Caspase凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平檢測結(jié)果見表4。

4 討論

已有研究對玄參環(huán)烯醚萜總苷進行分離、純化后發(fā)現(xiàn)，其主要由哈巴俄苷、哈巴苷、梓醇苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷等活性環(huán)烯醚萜苷類成分組成[16]。其中，哈巴俄苷、哈巴苷可減輕氧自由基對血管內(nèi)皮的損傷[17]，京尼平苷可抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB活化產(chǎn)生的抗炎反應(yīng)和鈣超載引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[18]，梓醇苷可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷[19]，桃葉珊瑚苷可緩解TNF-α誘導(dǎo)的心臟祖細胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，大鼠造模后的心電圖S-T段顯著抬高，LVEDd和LVEDs均顯著增加，LVEF和LVFS均顯著降低；血清中LDH、CK-MB、cTnⅠ、NT-pro BNP、TNF-α水平均顯著升高；心肌組織有大量黃褐色凋亡細胞；心肌組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高。這表明大鼠心肌梗死模型建立成功，其心功能明顯受損，心肌細胞出現(xiàn)炎性損傷，并發(fā)生明顯凋亡。與模型組比較，給予不同劑量玄參環(huán)烯醚萜總苷干預(yù)后，大鼠的上述指標(biāo)及心肌組織病理學(xué)變化均有顯著改善，表明玄參環(huán)烯醚萜總苷能顯著減輕心肌梗死模型大鼠的癥狀，恢復(fù)大鼠心功能，抑制心肌細胞凋亡，對缺血性心肌細胞炎癥損傷具有明顯的保護作用。

細胞凋亡是指機體細胞在自身發(fā)育過程中或外在因素作用下，通過細胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而自發(fā)的一種程序性死亡[18]。Caspase是一類與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，其成員在氨基酸序列、結(jié)構(gòu)及酶的特性上均相似，通常以無活性的酶原形式存在于大多數(shù)生物細胞中[21]。Caspase酶原必須通過自身活化或相互激活，重新組裝形成活性復(fù)合物才能啟動凋亡程序。目前，經(jīng)典的細胞凋亡途徑包括由不同Caspase成員啟動的3條途徑：（1）Caspase-8啟動的外源性途徑，又稱死亡受體途徑；（2）Caspase-9啟動的內(nèi)源性途徑，又稱線粒體途徑；（3）Caspase-12（鼠類）啟動的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[8]。

外源性途徑始于細胞表面死亡受體Fas、TNF受體1（TNFR1）的激活，當(dāng)Fas配體（FasL）和TNF-α等凋亡信號分子作用于相應(yīng)的受體后，會發(fā)生一系列反應(yīng)生成凋亡復(fù)合物，從而激活Caspase-8酶原[22-23]。活化的Caspase-8可激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示，玄參環(huán)烯醚萜總苷干預(yù)后可顯著降低心肌梗死模型大鼠的血清TNF-α水平和心肌組織中Caspase-8的蛋白表達水平，表明其可阻止TNF-α參與形成凋亡復(fù)合物，抑制Caspase-8的活化，最終避免激活Caspase-3促進細胞凋亡。

內(nèi)源性凋亡途徑由細胞線粒體的功能異?；驌p傷所致，因此也被稱為線粒體途徑。在梗死的心肌組織中，側(cè)支循環(huán)缺血-再灌注可導(dǎo)致胞內(nèi)氧自由基的累積，使線粒體外膜受到氧化損傷[24]，此時促進細胞存活的Bcl-2和促進細胞凋亡的Bax表達量發(fā)生逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致線粒體膜通透性增大[25]，大量Cyt C釋放至細胞漿中并激活Caspase-9酶原，活化后的Caspase-9可激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡[26]。本實驗結(jié)果顯示，玄參環(huán)烯醚萜總苷干預(yù)后可顯著升高心肌梗死模型大鼠心肌細胞中的SOD活性、降低MDA含量，表明其可減少心肌缺血-再灌注產(chǎn)生的氧自由基；同時，其可上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達量，進而抑制Cyt C釋放入胞漿激活Caspase-9，從而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)合成折疊的場所，當(dāng)心肌組織發(fā)生缺血-再灌注時，可導(dǎo)致Na+-Ca2+交換增加，使胞外Ca2+大量內(nèi)流造成胞內(nèi)Ca2+超載，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)使其內(nèi)部的蛋白質(zhì)折疊錯誤并過度聚集，最終觸發(fā)細胞凋亡信號[27]。很多細胞在凋亡早期均出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度迅速持續(xù)升高的現(xiàn)象，以致激活胞質(zhì)中的鈣依賴性蛋白酶Calpain，而Calpain能直接激活Caspase-12，活化后的Caspase-12又可激活Caspase-3，使凋亡繼續(xù)進行[28]。本實驗結(jié)果顯示，玄參環(huán)烯醚萜總苷干預(yù)后可顯著降低心肌梗死模型大鼠心肌細胞中Caspase-12、Calpain的蛋白表達水平，表明其可抑制心肌缺血-再灌注引發(fā)的Ca2+超載，從而阻止Caspase-12活化并傳遞凋亡信號。

綜上所述，玄參環(huán)烯醚萜苷可同時通過抑制Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12相關(guān)的3條凋亡通路，繼而抑制對Caspase-3的激活而起到抗心肌細胞凋亡作用，由此發(fā)揮對大鼠心肌缺血性損傷的保護作用。

參考文獻

[ 1 ] 盧芳，于卉，張寧，等.玄參保護心血管系統(tǒng)的藥理作用研究進展[J].中國藥房，2016，27（22）：3148-3150.

[ 2 ] 趙秀君，賈文亮.玄參為主組方治療心血管病[J].中醫(yī)雜志，2010，51（3）：249.

[ 3 ] 薛剛強，杜婧，潘新艷，等.玄參化學(xué)成分研究[J].中藥材，2014，37（9）：1597-1599.

[ 4 ] 杜曉煌，方勇飛，李莉，等.玄參主要成分生物活性研究進展[J].中國藥房，2015，26（15）：2158-2160.

[ 5 ] 張佩，王承龍，劉劍剛，等.缺血性心臟病心肌能量代謝障礙的研究進展[J].心臟雜志，2018，30（2）：207-211、217.

[ 6 ] 夏強，錢令波.心腦缺血再灌注損傷的機制及防治策略研究進展[J].浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，39（6）：551-558.

[ 7 ] 李曉云，桂慶軍.Caspase家族與冠心病研究現(xiàn)狀及其進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31（1）：70-72.

[ 8 ] 岳原亦，張揚，張一奇.Caspase家族與細胞凋亡[J].中國醫(yī)療前沿，2011，6（6）：25-26.

[ 9 ] 潘曉冬.金銀花和玄參抗心肌細胞凋亡作用及機制研究[D].哈爾濱：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，2014.

[10] 馮驍，田聆，黃倩.Caspase-3基因表達調(diào)控研究進展[J].生命科學(xué)，2014，26（9）：936-942.

[11] 周洪偉，郝麗靜，楊勇，等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化玄參提取工藝[J].世界中醫(yī)藥，2012，7（5）：455-457.

[12] 李祚丹.玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的分離純化研究[D].重慶：重慶大學(xué)，2014.

[13] 王鑫，宋佳格，穆成吉，等.冠狀動脈結(jié)扎法制作大鼠心梗模型研究進展[J].廣州醫(yī)藥，2016，47（6）：93-96.

[14] 熊遠珍.實驗動物與人用藥量的新?lián)Q算[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997（4）：41.

[15] 盧芳，于卉，李自輝，等.玄參及其拆分組分對異丙腎上腺素致大鼠心室重構(gòu)的影響[J].中藥材，2016，39（4）：863-866.

[16] 謝小艷，夏春森.中藥玄參的化學(xué)成分及藥理研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（5）：121-125.

[17] 崔忠生，邸科前，馬煥云.哈巴苷及哈巴俄苷對過氧化氫損傷血管內(nèi)皮細胞的保護作用[J].醫(yī)學(xué)研究與教育，2009，26（2）：11-12.

[18] 楊軼舜，張彤，于篩成.京尼平的研究進展及其藥理價值[J].中成藥，2011，33（1）：130-133.

[19] 畢方杰，張虎，胡健.梓醇對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷的保護作用及機制研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，42（3）：244-248.

[20] 李春曉，李慧影，王虹，等.桃葉珊瑚苷通過ERβ途徑抑制TNF-α誘導(dǎo)的心臟祖細胞凋亡[J].中國藥理學(xué)通報，2016，32（8）：1068-1074.

[21] 王筱冰，張小翠，夏妙紅，等.Caspase的活化機制[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2006，6（3）：53-55.

[22] TUMMERS B，GREEN DR. Caspase-8：regulating life and death[J]. Immunol Rev，2017，277（1）：76-89.

[23] LIU X，SHI F，LI Y，et al. Post-translational modifications as key regulators of TNF-induced necroptosis[J]. Cell Death Dis，2016，6（7）：1-9.

[24] CADENAS S. Mitochondrial uncoupling，ROS generation and cardioprotection[J]. Biochim Biophys Acta Bioenerg，2018，1859（9）：940-950.

[25] 王衛(wèi)東，陳正堂.Bcl-2/Bax比率與細胞“命運”[J].中國腫瘤生物治療雜志，2007，14（4）：393-396.

[26] WU CC，BRATTON SB. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species[J]. Antioxid Redox Signal，2013，19（6）：546-558.

[27] 朱靜峰，黃冬.氧自由基、鈣超載與心肌缺血再灌注損傷[J].云南醫(yī)藥，2007，28（1）：67-70.

[28] MINAMINO T，KITAKAZE M. ER stress in cardiovascular disease[J]. J Mol Cell Cardiol，2010，48（6）：1105- 1110.

（收稿日期：2018-10-08 修回日期：2019-02-01）

（編輯：段思怡）