PTPN14過表達對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞增殖和凋亡影響

袁雪蓮 樂珍 劉國炳

[摘要]?目的?探討非受體蛋白質酪氨酸磷酸酶14（PTPN14）過表達對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞增殖和凋亡的影響及其機制。

方法?將體外培養(yǎng)的HEC-1A細胞分為A組（未轉染）、B組（轉染陰性對照質粒）和C組（轉染PTPN14過表達質粒）。采用蛋白質印跡（Western blot）法檢測PTPN14蛋白和Yes相關蛋白（YAP蛋白）的表達，定量實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測PTPN14 mRNA和YAP mRNA的表達;細胞計數(shù)（CCK-8）法檢測細胞增殖;流式細胞儀檢測細胞凋亡。

結果?與A組比較，C組細胞中PTPN14蛋白和mRNA的表達水平以及細胞凋亡率均顯著升高，細胞增殖活力以及YAP蛋白和mRNA的表達水平均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（t=5.752～37.554，P<0.01）;而B組和C組間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

結論?過表達PTPN14能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，其作用機制可能與下調(diào)YAP蛋白表達有關。

[關鍵詞]?子宮內(nèi)膜腫瘤;蛋白質酪氨酸磷酸酶，非受體14型;細胞增殖;細胞凋亡;YAP蛋白

[中圖分類號]?R737.33

[文獻標志碼]?A

[文章編號]??2096-5532（2019）06-0705-05

doi：10.11712/jms201906018

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

EFFECT OF THE OVEREXPRESSION OF PROTEIN TYROSINE PHOSPHATASE， NON-RECEPTOR TYPE 14 ON THE PROLI-

FERATION AND APOPTOSIS OF ENDOMETRIAL CARCINOMA HEC-1A CELLS

YUAN Xuelian， LE Zhen， LIU Guobing

（Department of Obstetrics and Gynecology， The First People’s Hospital of Zhengzhou， Zhengzhou 450018， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of the overexpression of protein tyrosine phosphatase， non-receptor type 14 （PTPN14） on the proliferation and apoptosis of endometrial carcinoma HEC-1A cells and related mechanism.

Methods

HEC-1A cells cultured in vitro were divided into group A （untransfected）， group B （transfected with negative control plasmid）， and group C （transfected with PTPN14-overexpression plasmid）. Western blot was used to measure the protein expression of PTPN14 and Yes-related protein （YAP）， and qRT-PCR was used to measure the mRNA expression of PTPN14 and YAP. CCK-8 assay was used to measure cell proliferation， and flow cytometry was used to detect cell apoptosis.

Results Compared with group A， group C had significant increases in the protein and mRNA expression of PTPN14 and apoptosis rate of cells， as well as significant reductions in cell proliferation activity and the protein and mRNA expression of YAP （t=5.752-37.554，P<0.01）， and there were no significant differences between group B and group C （P>0.05）.

Conclusion Overexpression of PTPN14 can inhibit the proliferation of endometrial carcinoma cells and induce apoptosis， possibly by downregulating the expression of YAP.

[KEY WORDS] endometrial neoplasms; protein tyrosine phosphatase， non-receptor type 14; cell proliferation; apoptosis; YAP protein

子宮內(nèi)膜癌是一種婦科常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率有明顯上升和年輕化的趨勢[1-3];盡管以手術為主的綜合治療使子宮內(nèi)膜癌的治療效果得到了很大改善，但仍有病人出現(xiàn)轉移、復發(fā)和耐藥等現(xiàn)象，導致預后不佳[4-5]。非受體蛋白質酪氨酸磷酸酶14 （PTPN14） 是蛋白酪氨酸磷酸酶家族（PTPs）成員，在調(diào)節(jié)細胞周期、細胞增殖和侵襲等過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。研究指出，PTPN14在胃癌上皮間質轉化過程中發(fā)揮著重要作用，PTPN14缺失是造成乳腺細胞惡性增殖的重要原因之一[8-9]。目前，關于PTPN14在子宮內(nèi)膜癌中的作用及機制的研究未見報道。故本研究通過上調(diào)PTPN14表達，觀察其對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞增殖和凋亡影響，并探討其可能的作用機制。

1?材料與方法

1.1?主要試劑

Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Lipofec-tamineTM 2000以及胎牛血清均購于美國Invitrogen公司，PTPN14過表達質粒和陰性對照質粒購于北京普如汀生物技術公司，RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、AnnexinV-PE/7-AAD調(diào)亡試劑盒、Trizol裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒和CCK-8試劑購于南京凱基生物公司，PTPN14單克隆抗體、Yes相關蛋白（YAP蛋白）單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠IgG二抗均購于北京中杉金橋公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2?細胞培養(yǎng)和構建PTPN14過表達細胞

取保存于本實驗室的HEC-1A細胞冷凍管，以溫水浴融化后，轉移至含有適量DMEM培養(yǎng)基（含體積分數(shù)0.10胎牛血清）的離心管中，離心、棄上清。加入DMEM培養(yǎng)基重懸細胞后，再轉至培養(yǎng)瓶中，放于設定條件為飽和濕度、37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)預培養(yǎng)。每2 d更新培養(yǎng)基，以光鏡觀察細胞的生長情況，待細胞幾乎完全鋪滿培養(yǎng)瓶時，進行傳代。取對數(shù)生長期的HEC-1A細胞，以磷酸緩沖液洗滌細胞后，加入2.5 g/L胰蛋白酶溶液，待細胞從瓶底脫落后，加入培養(yǎng)基（含體積分數(shù)0.10胎牛血清）終止消化，細胞計數(shù)，以每孔3萬個細胞接種至6孔板上，將細胞隨機分為空白組（未處理，A組）、陰性組（轉染陰性對照質粒，B組）和過表達組（轉染PTPN14質粒，C組）。置培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜，次日轉染。按照LipofectamineTM 2000說明書操作步驟分別將經(jīng)Opti-MEM稀釋的PTPN14質粒和陰性對照質粒加入過表達組和陰性組細胞，空白組加入等量Opti-MEM。轉染6 h后更換培養(yǎng)液，再培養(yǎng)48 h后收集各組對數(shù)生長期細胞，采用蛋白質印跡（Western blot）法和定量實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR）分別檢測各組細胞中PTPN14蛋白和mRNA，以得到PTPN14過表達的HEC-1A細胞。

1.3?PTPN14蛋白和mRNA檢測

采用Western blot法檢測PTPN14蛋白的表達。收集1.2中轉染48 h后的各組細胞，以蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法定量其濃度。將60 μg蛋白樣品上樣至120 g/L的SDS-PAGE凝膠中電泳分離，結束后轉PVDF膜。室溫下，以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入PTPN14（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗，于4 ℃下過夜。TBST洗膜3次后，加入二抗（1∶2 000），37 ℃下孵育2 h，洗膜后以ECL顯色，Bio-Rad成像儀拍照。采用Image軟件計算各組HEC-1A細胞中PTPN14蛋白的相對表達量。每組細胞設3個重復。

用qRT-PCR檢測PTPN14 mRNA表達。收集1.2中轉染48 h后的各組細胞，以 Trizol法提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系20 μL：上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，Taq酶0.5 μL，Master Mix 10.5 μL，ddH2O 7.0 μL。反應條件：95 ℃預變性180 s;94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，35個循環(huán);最后，72 ℃總延伸360 s。以GAPDH作內(nèi)參基因，2-△△Ct法計算PTPN14 mRNA相對表達量。每組細胞設3個重復。qRT-PCR所用引物及其序列見表1。

1.4?細胞增殖檢測

收集轉染48 h的各組細胞，經(jīng)2.5 g/L胰酶消化后，重懸細胞，以每孔5萬個細胞接種到96孔板上，每組設5個復孔。分別于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48、72和96 h后，取培養(yǎng)板棄培養(yǎng)液，向每孔加入CCK-8溶液20 μL。再培養(yǎng)4 h后，應用酶標儀檢測，記錄各組細胞在450 nm波長處的吸光度（A）值。每組實驗重復3次。

1.5?細胞凋亡檢測

收集1.2中轉染48 h后的各組細胞，胰酶消化后，離心棄培養(yǎng)基，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再離心。將7-AAD染液與Binding Buffer以1∶10比例混勻后，加入細胞中，避光下充分反應20 min，先加Binding Buffer 450 μL，再加Aimexin V-PE 1 μL混勻，避光反應15 min后，以流式細胞儀進行檢測。

1.6?YAP蛋白和mRNA檢測

收集1.2中轉染48 h后的各組細胞，分別用Western blot和qRT-PCR檢測各組細胞中YAP蛋白和mRNA的表達情況，具體步驟見1.3。其中，YAP一抗稀釋比例為1∶500，YAP擴增正向引物序列為5′-CGCTCTTCAACGCCGTCA-3′，反向引物序列為5′-AGTACTGGCCTGTCGGGAGT-3′，退火溫度為60 ℃。

1.7?統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有顯著性。

2?結?果

2.1?HEC-1A細胞轉染檢測

Western blot和qRT-PCR檢測結果表明，A、B和C組間PTPN14蛋白和mRNA表達水平差異有顯著性（F=84.336、924.035，P<0.01）。相對于A組，B組細胞中PTPN14蛋白和mRNA表達水平差異無顯著性（t=0.657、0.788，P>0.05）;C組與A組比較，PTPN14蛋白和mRNA表達水平明顯升高（t=10.833、37.554，P<0.01）。見圖1和表2。

2.2?過表達PTPN14對子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞增殖的影響

CCK-8法檢測結果顯示，各組細胞的增殖活力存在顯著性差異（F=19.233～87.200，P<0.01）。與A組比較，同一時間下，C組細胞的增殖活力均明顯減弱（t=5.752～12.017，P<0.01），而B組細胞的增殖活力無明顯變化（t=0.868～1.265，P>0.05）。見表3。

2.3?過表達PTPN14對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡影響

流式細胞術分析結果表明，A組、B組和C組細胞凋亡率分別為（8.28±1.52）%、（9.15±1.36）%和（21.78±3.28）%，組間比較差異有顯著意義（F=34.44，P<0.01）。C組與A組比較差異有顯著性（t=7.414，P<0.01），而B組與A組間差異無顯著性（t=0.478，P>0.05）。見圖2。

2.4?過表達PTPN14下調(diào)YAP表達

Western blot和qRT-PCR進一步檢測結果顯示，3組細胞中YAP蛋白和mRNA的表達水平存在顯著差異（F=85.605、564.237，P<0.01）。與A組相比較，B組細胞中YAP蛋白和mRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（t=1.032、2.265，P>0.05），而C組細胞中YAP蛋白和mRNA均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（t=12.293、28.562，P<0.01）。見圖3和表3。

3?討?論

PTPs是構成細胞信號轉導通路的重要部分，通過蛋白酪氨酸磷酸化參與分子翻譯修飾，在生長發(fā)育、免疫反應和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)因子的作用[10-12]。PTPN14作為PTPs中的一員，在多種腫瘤細胞中發(fā)揮著抑癌基因的作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳癌中敲除PTPN14可通過抑制可溶性膜結合蛋白的轉運，促進MDA-MB-231細胞生長和轉移;反之，高表達PTPN14可抑制乳癌細胞的增殖能力[14-15]。在食管癌中，轉染PTPN14質粒上調(diào)EC9706中PTPN14的表達后，細胞周期被阻滯在G1期，細胞增殖明顯受到抑制[16]。還有研究結果顯示，PTPN14是miR-21的靶基因，下調(diào)

PTPN14在肝內(nèi)膽管癌細胞中的表達，細胞增殖得到促進，細胞凋亡受到抑制[17]。目前，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生過程尚不明確，而PTPN14在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未見報道。本研究通過體外實驗的方法，以脂質體法上調(diào)PTPN14在子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞中的表達，探討過表達PTPN14對HEC-1A細胞增殖凋亡影響。結果表明，過表達PTPN14能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。提示PTPN14在子宮內(nèi)膜癌腫瘤細胞生長過程中發(fā)揮著重要作用。

YAP是一種重要的基因轉錄共激活因子，在Hippo信號通路中發(fā)揮著關鍵作用，通過與轉錄因子TEAD的結合調(diào)控下游基因的表達，發(fā)揮著促生長、轉移和抑凋亡的重要作用[18-21]。有研究指出，YAP在子宮內(nèi)膜癌中高表達，與淋巴結轉移、整體生存率、組織學分級和預后等密切相關[22]，且參與子宮內(nèi)膜細胞的增殖和上皮間質轉化等過程[23-24]。在乳腺上皮細胞中，PTPN14下調(diào)能夠激活擬表型YAP，并且協(xié)同YAP誘導細胞的惡性轉化[25]。為了探討過表達PTPN14抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的分子機制，本研究進一步檢測過表達PTPN14對HEC-1A細胞中YAP蛋白及mRNA表達的影響。結果表明，過表達PTPN14的HEC-1A細胞中YAP蛋白及mRNA表達水平較對照組均顯著降低。結果提示，過表達PTPN14可能通過下調(diào)YAP表達發(fā)揮著抑制HEC-1A細胞增殖和促進細胞凋亡的作用。

總之，PTPN14在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，過表達PTPN14能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，其作用機制可能與下調(diào)YAP表達有關。本研究僅從細胞水平闡述了PTPN14在子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞增殖凋亡中的作用，該結果為后續(xù)探討PTPN14在構建的子宮內(nèi)膜癌裸鼠原位移植模型中的作用打下了基礎，并為子宮內(nèi)膜癌的治療提供了新的靶點和線索。

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