白芷、吳茱萸、川芎對偏頭痛大鼠血清ENK、β-EP含量及腦干組織C-FOS表達的影響

吳輝 陳曉光 魏丹 蘇曼莉 姚漢云 劉慧 王淼

〔摘要〕 目的 觀察單味中藥白芷、吳茱萸、川芎對偏頭痛模型大鼠神經遞質及腦干C-FOS表達的影響。方法 將48只Wistar大鼠隨機分為6組（每組8只）：空白組、模型組、白芷治療組、吳茱萸治療組、川芎治療組、西比靈治療組（藥物對照）。各治療組分別按0.79 g/kg、0.40 g/kg、0.79 g/kg、0.43 mg/kg干預，模型及空白組灌胃相同體積生理鹽水，連續(xù)7 d。除空白組外，均于末次灌胃1 h后，硝酸甘油10 mg/kg皮下注射方法制備大鼠偏頭痛模型。4 h時采血，ELISA法檢測血清腦啡肽（Enkephalin， ENK）、β內啡肽（β-Endorphin， β-EP）含量;免疫組化方法檢測腦干組織C-FOS表達;并觀察各組大鼠行為學表現(xiàn)。結果 與空白組比較，模型組動物血清ENK含量顯著增高（P<0.05），血清β-EP含量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，各治療組ENK含量及C-FOS表達降低（P<0.05），β-EP含量顯著增高（P<0.05）;川芎組ENK含量低于白芷組（P<0.05），川芎組C-FOS表達低于吳茱萸組（P<0.05）。結論 3種中藥均能改善偏頭痛動物雙耳變紅、撓頭、爬籠、豎耳、皮膚發(fā)紺等行為學表現(xiàn)，減少ENK分泌，增加β-EP含量，降低C-FOS表達。

〔關鍵詞〕 偏頭痛;川芎;白芷;吳茱萸;C-FOS;腦干

〔中圖分類號〕R285.5&nbsp; ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.009

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of single traditional Chinese medicine （TCM）-Radix Angelicae Dahuricae， Fructus Evodiae and Rhizoma Chuanxiong on neurotransmitters and the expression of C-FOS in the brainstem of migraine model rats. Methods A total of 48 Wistar rats were randomly divided into 6 groups （each group of 8 rats）： a blank group， a model group， a Radix Angelicae Dahuricae group （BZ group， 0.79 g/kg）， a Fructus Evodiae group （WZY group， 0.40 g/kg）， a Rhizoma Chuanxiong group （CX group， 0.79 g/kg） and a drug control group （XBL group， 0.43 mg/kg）. Each treatment group was given its respective medicine， while the blank group and the model group were given the same volume of normal saline by gavage， for 7 d. Except for the blank group， the rat model of migraine was prepared by subcutaneous injection of nitroglycerin 10 mg/kg at 1 h after the last gavage. At the end of 4 h， blood was collected. The content of enkephalin （ENK） and β-endorphin （β-EP） in serum was tested by ELISA， and the expression of C-FOS in brainstem was detected by immunohistochemistry （IHC）. And the behavior of each group of rats was observed. Results Compared with the blank group， the content of ENK in serum in the model group was significantly increased （P<0.05）， and the content of β-EP in serum was significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the content of ENK and the expression of C-FOS in each treatment group were decreased obviously （P<0.05）， and the content of β-EP was increased significantly （P<0.05）. The ENK content of the CX group was lower than that in the BZ group （P<0.05）， and the C-FOS expression of the CX group was lower than that in the WZY group （P<0.05）. Conclusion The 3 kinds of TCM can improve the behavioral performance of migraine animals such as red ears， head scratching， climbing cage， erect ears and cyanosis， reduce the secretion of ENK， increase the content of β-EP and decrease the expression of C-FOS.

〔Keywords〕 migraine; Rhizoma Chuanxiong; Radix Angelicae Dahuricae; Fructus Evodiae; C-FOS; brainstem

偏頭痛（Migraine）是一種反復發(fā)作的血管性頭痛，呈一側或兩側疼痛，常伴惡心、嘔吐、畏光等癥狀。少數(shù)典型者發(fā)作前有視覺、感覺和運動等先兆，可有家族史。2010年我國原發(fā)性頭痛流行病學調查顯示，偏頭痛發(fā)病率為9.3%。日本偏頭痛患病率為6.0%～8.4%，美國與歐洲約為12%[1]。30歲以下年齡組發(fā)病率有逐年增多的趨勢[2]。

偏頭痛屬于中醫(yī)學“頭痛”范疇。中醫(yī)藥治療本病經驗豐富，教材《中醫(yī)內科學》《中藥學》在論及頭痛、偏頭風的治療時均用到川芎、白芷、吳茱萸，但沒有說明三者功效的差別，僅有“頭痛不離川芎”之說，似乎川芎治療頭痛效果最好，但無明確說明。本實驗利用硝酸甘油（Glyceryltrinitrate， GTN）制備大鼠Migraine模型，觀察三種中藥對腦啡肽（Enkephalin，ENK）、β內啡肽（β-Endorphin， β-EP）含量及腦干組織C-FOS表達的影響，了解三者之間的療效差異，指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

Wistar大鼠48只，雌雄各半（200±10）g，購于湖北省動物中心，動物合格證編號：42000600012121。動物實驗在武漢市第一醫(yī)院屏障動物室內進行，動物設施使用證編號：00137527。動物室內12 h晝夜交替，實驗動物飼喂維持飼料（北京華阜康公司），自由飲去離子水。

1.2? 實驗藥物

白芷、吳茱萸、川芎購于武漢市第一醫(yī)院中藥房，由湖北天濟中藥飲片有限公司炮制、包裝，批號分別為20150912、20150921、201510022。單味中藥浸泡30 min后，大火煎開，改小火30 min，雙層紗布過濾;再加水煎煮一次，合并2次濾液，分別濃縮至0.67 g/mL、0.50 g/mL、0.67 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?硝酸甘油由河南潤弘制藥股份有限公司生產，批號1503302，5 mg/mL;鹽酸氟桂利嗪膠囊（西比靈）由西安楊森生產，批號150424975，5 mg/粒。

1.3? 儀器及試劑

1.3.1? 儀器? MK3型酶標儀（美國熱電）;動物室監(jiān)控系統(tǒng)（SONY-GEDVR-WTO）;千屏顯微圖像采集系統(tǒng)（武漢千屏）。

1.3.2? 試劑? ENK、β-EP等指標ELISA檢測試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號分別為10-61-499，10-61-497），組化用兔抗大鼠一抗C-fos（Bioworld， BS6433），組化檢測試劑盒（Servicebio，G1210，含二抗），水合氯醛（上海山浦化工有限公司，AR，批號20150312）。

1.4? 分組及干預

48只大鼠隨機分為6組，每組8只（雌雄各半），分別為：模型組與空白組分別灌胃2 mL生理鹽水，白芷組按0.79 g/kg質量灌胃白芷煎煮液（按人與大鼠體表面積換算）2 mL、吳茱萸組按0.40 g/kg體質量灌胃吳茱萸煎煮液2 mL、川芎組按0.79 g/kg體質量灌胃川芎2 mL、西比靈組按0.43 mg/kg體質量灌胃西比靈混懸液2 mL，連續(xù)7 d;在第7天灌胃1 h后，空白組皮下注射生理鹽水，其他各組均按10 mg/kg劑量皮下注射硝酸甘油[3]。

1.5? 指標檢測

1.5.1? 行為學觀察? 從造模時起，利用動物室監(jiān)控系統(tǒng)，于注射硝酸甘油后連續(xù)攝錄3 h內各動物的行為（包括耳朵變紅、撓頭、甩頭、爬籠、豎耳、豎毛、皮膚發(fā)紺等現(xiàn)象）。每30分鐘為1個時間段，觀察攝錄資料中各組動物雙耳紅出現(xiàn)時間及觀察時間段內動物撓頭次數(shù)。撓頭開始時間以大鼠撓頭次數(shù)>5次以上次為標志，消失時間以撓頭次數(shù)<5次并出現(xiàn)倦怠表現(xiàn)為標志[4]。

1.5.2? 血清ENK、β-EP含量檢測? 注射硝酸甘油后4 h以10%水合氯醛腹腔注射麻醉動物，腹主動脈采血（分離膠管盛裝），分離膠管于室溫放置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）按試劑盒說明書操作方法來檢測各組動物血清ENK、β-EP含量。

1.5.3? 腦干組織免疫組化檢測? 4%多聚甲醛固定腦干組織經常規(guī)方法包埋，將所切白片置于58 ℃烤片1 h;恢復室溫后將樣本脫蠟至水;微波加熱進行抗原修復;滴加3%雙氧水于玻片上孵育10 min消除內源性過氧化物酶活性，再以雙蒸水清洗3次，每次3 min;滴加正常山羊血清室溫下孵育12 min;滴加1∶80稀釋一抗（C-FOS），于濕盒中4 ℃孵育過夜;取出濕盒室溫放置20 min，PBS浸洗3次，每次3 min;滴加生物素標記二抗，室溫孵育30 min;PBS浸洗3次，每次3 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，室溫孵育30 min;PBS沖洗3次，每次5 min;新鮮配制DAB染色30 min，流水沖洗2 min;蘇木素復染，鹽酸酒精返藍;自來水沖洗后脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，胞漿棕褐色為陽性表達。用IPP 6.0軟件計算各組陽性表達OD值，并與空白組比較計算各組相對表達量。

1.6? 統(tǒng)計分析

用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以“x±s”表示，實驗數(shù)據(jù)用單因素方差分析進行統(tǒng)計。如果方差齊性，即用最小顯著差數(shù)法（LSD）完成組間比較，如果方差不齊，則用Dunnett's T3進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 各組動物行為學改變

模型組動物在3 min左右出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、上肢撓頭頻繁、煩躁、爬籠次數(shù)增加等現(xiàn)象，1～3 h后，現(xiàn)倦怠、活動減少等癥狀?？瞻捉M未見雙耳發(fā)紅，僅偶爾出現(xiàn)撓頭、爬籠現(xiàn)象。如表1所示，各組動物耳紅出現(xiàn)時間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.831）。

2.2? 各組動物不同時間段撓頭次數(shù)比較

如表1所見，與空白組比較，模型組各時間段撓頭次數(shù)均顯著增高（P=0.000）;與模型組比較，各個時間段3組中藥組撓頭次數(shù)均顯著降低（P=0.000），西比靈組31～60 min段、61～90 min段、91～120 min段、121～150 min時間段撓頭次數(shù)顯著降低（P值分別為0.000，0.000，0.000，0.000，0.029）;與川芎組比較，0～30 min時間段白芷組和吳茱萸組撓頭次數(shù)均顯著增高（P值分別為0.001，0.000），91～120 min時間段吳茱萸組撓頭次數(shù)顯著降低（P=0.004），在31～60 min、61～90 min及151～180 min時間段白芷組撓頭次數(shù)均顯著增高（P=0.000，0.007，0.020）。

2.3? 各組動物血清ENK、β-EP含量比較

與空白組比較，模型組血清ENK含量顯著增高（P=0.004），β-EP含量顯著降低（P=0.002）;與模型組比較白芷組、吳茱萸、西比靈組ENK含量降低（P值分別為0.000，0.001，0.026），白芷組B-EP含量顯著增高（P=0.001）;與西比靈組比較，白芷組ENK含量顯著降低（P=0.036），白芷組、吳茱萸組、川芎組B-EP含量均顯著增高（P值分別為0.000，0.004，0.003）;與川芎組比較，白芷組ENK含量顯著降低（P=0.011），白芷組β-EP含量顯著增高（P=0.026），見表2。

2.4? 各組動物腦干C-FOS表達比較

各組之間C-FOS表達有顯著差異（方差分別為6.327，P=0.021），進一步兩兩比較結果顯示，與空白組比較，模型組C-FOS表達顯著增高（P=0.033）;與模型組比較，各個治療組C-FOS表達均顯著降低（P值分別為0.002，0.025，0.005，0.039）;與西比靈組比較，白芷組C-FOS表達顯著降低（P=0.042）;川芎組C-FOS表達顯著低于吳茱萸組（P=0.041），見表2、圖1。

3 討論

偏頭痛是臨床常見的一種慢性神經血管病，具有無法根治、反復發(fā)作并容易伴有精神障礙等特點，對患者生活質量影響巨大。大多數(shù)患者發(fā)病時會影響學習或工作。世界衛(wèi)生組織（WTO）發(fā)布的常見疾病按健康壽命損失年（years lived with disability， YLD）排列中，偏頭痛位列第20位，且將嚴重偏頭痛定為最嚴重致殘的慢性疾病，等同于癡呆、癱瘓和嚴重精神病[5]。因此防治偏頭痛是亟待解決的公共健康課題。

阿片肽系統(tǒng)是參與高級中樞對傷害性刺激內源性調節(jié)的相關遞質之一，是控制痛覺的主要遞質，其中ENK和β-EP在腦內和脊髓內均有鎮(zhèn)痛作用，β-EP在腦內含量遠遠大于脊髓，ENK在脊髓發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，而在腦內反而有對抗嗎啡鎮(zhèn)痛作用。β-內啡肽由31個氨基酸組成，主要在垂體合成，是β脂肪酸釋放激素的第36～91氨基酸序列，存在于丘腦、垂體、腎上腺及其他外周組織中。有研究認為偏頭痛是由于傷害感受系統(tǒng)的神經遞質功能失調引起的，β-內啡肽是其中最重要的神經遞質[6]，β-EP釋放減少時，其抑制去甲腎上腺素神經元胞體活性的能力下降導致頸部血管收縮舒張失調，造成同側頸內動脈收縮和頸外動脈舒張，與偏頭痛的前驅期和頭痛期血管變化一致[7]，因此認為β-EP具有緩解偏頭痛的作用。

C-FOS基因屬于即刻早期基因，對神經遞質、激素、神經沖動及外界刺激引起的傳入信息在數(shù)分鐘內即可做出反應并進行表達，作為神經元激活的標志物，是細胞外刺激、激活神經元的敏感指標，并廣泛用于多種疼痛研究。正常情況下，C-FOS很少表達，各種如疼痛、創(chuàng)傷等傷害性刺激均可誘導中樞神經系統(tǒng)C-FOS表達，其表達水平與痛覺調控密切相關。FOS蛋白與JUN蛋白在胞核中相互連接形成二聚體復合物，并結合目的基因中的AP-1位點，進一步激活目的基因表達最終對疼痛刺激作出反應[8-10]。

中醫(yī)學認為，偏頭痛屬于“偏頭風”“頭風”“腦痛”“偏頭痛”等范疇，系由風邪、氣郁、肝陽上擾或痰濁、淤血阻滯腦絡，不通則痛，發(fā)為本病。通過對《中醫(yī)方劑大辭典》中治療頭痛、偏頭痛方劑的分析發(fā)現(xiàn)，白芷-川芎組合出現(xiàn)的頻率最高，其機制與抗炎及能量代謝相關通路有關[11]。川芎是治頭痛要藥，現(xiàn)代藥理研究也證實川芎中揮發(fā)油成分有鎮(zhèn)痛作用[12]，白芷能祛風止痛，善治頭面部的疼痛，這二味藥在1994-2007年中藥治療偏頭痛的文獻分析中屬于高頻率使用藥物[13];吳茱萸為治療肝寒氣滯諸痛主藥，《傷寒論·辨厥陰病脈證并治》：“干嘔，吐涎沫，頭痛者，吳茱萸湯主之?！?/p>

本研究顯示，偏頭痛模型組及各治療組大鼠皮下注射硝酸甘油約4 min時雙耳變紅，繼而出現(xiàn)煩躁、活動增多，前肢及后肢搔頭頻繁，中藥治療組及西比靈治療組動物煩躁、撓頭次數(shù)較模型組少，三種中藥組在90 min左右時搔頭減少，120 min后逐漸開始倦臥，期間有間斷活動。在皮下注射硝酸甘油后動物血清ENK含量增高，β-EP含量降低，腦干組織C-FOS表達增高，川芎治療組ENK含量顯著低于白芷組（P<0.05），β-EP含量高于白芷組（P<0.01），C-FOS表達低于吳茱萸組（P<0.05）。從各組動物行為改變看，開始階段川芎治療組撓頭次數(shù)最低，且維持時間較長;吳茱萸組撓頭次數(shù)梯次降低較快，提示川芎、吳茱萸可能聯(lián)用療效較好。

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