新白8號(hào)枇杷果肉香氣成分及HS-SPME內(nèi)標(biāo)濃度分析

張桂彬 安寧 朱立輝 蔣際謀 胡文舜

摘 要：【目的】探究新白8號(hào)枇杷香氣成分及內(nèi)標(biāo)物的最適濃度，以期為白肉枇杷香氣成分的研究及內(nèi)標(biāo)選擇提供依據(jù)?！痉椒ā恳园兹忤凌诵掳?號(hào)果實(shí)為試材，加入4種不同濃度等體積的環(huán)己酮溶液（947、94.7、9.47、0.947μg·μL-1）為內(nèi)標(biāo)，采用HS-SPME-GC/MS技術(shù)，對(duì)試材的香氣成分進(jìn)行定性和定量分析?！窘Y(jié)果】新白8號(hào)枇杷果肉中共檢測(cè)出10類(lèi)43種香氣成分，以醛類(lèi)、烷烴、芳香烴、酮類(lèi)和醇類(lèi)為主，其中相對(duì)含量較高的物質(zhì)有己醛、（E）-2-己烯醛、正丁基環(huán)己烷、2-庚酮、正戊基環(huán)己烷、（E）-2-己烯-1-醇，苯乙烯等。4種環(huán)己酮濃度的樣品分別檢測(cè)出有效香氣化合物為30、39、41和32種，有效峰面積占總峰面積比分別為38.20%、28.49%、42.70%和39.51%;環(huán)己酮峰面積比分別為47.38%、58.55%、36.37%和25.86%。加入9.47 μg·μL-1環(huán)己酮的樣品檢測(cè)出的香氣物質(zhì)種類(lèi)最多、有效峰面積比最高、環(huán)己酮及各香氣成分峰面積占比適宜?！窘Y(jié)論】新白8號(hào)香氣成分豐富多樣，9.47 μg·μL-1環(huán)己酮為枇杷果實(shí)香氣成分固相微萃取的適宜內(nèi)標(biāo)濃度。

關(guān)鍵詞：枇杷;香氣;環(huán)己酮;內(nèi)標(biāo);固相微萃取;氣相色譜-質(zhì)譜

中圖分類(lèi)號(hào)：S 667.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）06-660-08

Abstract： 【Objective】 To determine the aromatic composition of loquat fruit and cyclohexanone concentration for the HS-SPME-GC/MS internal standard method. 【Methods】The pulp of Xinbai 8 fruits was added with a cyclohexanone solution in the concentration of 947， 94.7， 9.47， 0.947 μg·μL-1 at a same volume as the internal standard for HS-SPME-GC/MS analysis. 【Results】 The analysis detected 10 classifications of chemicals including aldehydes， alkanes， dutrex， ketones and alcohols. Hexanal， （E）-2-hexenal， n-butyl cyclohexane， 2-heptanone， n-pentyl cyclohexane， （E）-2-hexene-1-alcohol， and styrene were the dominating volatiles among the 43 compounds identified.In the cyclohexanone-added samples， the decreasing concentration produced 31， 40， 42 and 33 aromatic substances with the effective peak area ratios of 38.20%， 28.49%， 42.70% and 39.52%， and the peak area ratios of 38.20%， 58.55%， 36.37% and 25.86%， respectively. A maximum number of aromatics was found in the sample that was added with 9.47 μg·μL-1 cyclohexanone which also had the highest effective peak area ratio and optimum peak area radio. 【Conclusion】The aromatics in the fruits of Xinbai 8 were diverse， and the cyclohexanone concentration at 9.47 μg·μL-1 was the choice internal standard for the analytical.

Key words： loquat; aromatics; cyclohexanone; internal standard; SPME; GC-MS

0 引言

【研究意義】香氣是構(gòu)成和衡量枇杷風(fēng)味品質(zhì)的主要因素之一，對(duì)消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)有著重要影響 [1-2]。白肉枇杷素有鮮食枇杷“無(wú)冕之王”美譽(yù)，風(fēng)味濃郁是白肉枇杷的特點(diǎn)之一[3-4]。新白8號(hào)作為白肉枇杷優(yōu)良新品種，于2018年12月通過(guò)全國(guó)熱帶作物品種審定（熱品審2018007），具有晚熟果大，果肉細(xì)膩、化渣、濃甜，投產(chǎn)早且較豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)良品質(zhì)[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，對(duì)香氣成分的研究常采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction， HS-SPME）和氣質(zhì)（gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，它可以有效地定性和定量鑒別大量物質(zhì)[6]。色譜分析中常用的定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和峰面積歸一法;內(nèi)標(biāo)法由于進(jìn)樣量的變化和色譜條件的微小變化對(duì)其定量結(jié)果的影響不大而被廣泛應(yīng)用[7]，其關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物[8]?，F(xiàn)階段果實(shí)香氣物質(zhì)研究報(bào)道中，常用的內(nèi)標(biāo)物有環(huán)己酮（橙、楊梅、草莓、龍眼、梨等）[9-13]、2-辛酮（秋子梨）[14]、 2-辛醇（蘋(píng)果）[15]等，其中環(huán)己酮因化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且易揮發(fā)而應(yīng)用較廣。【本研究切入點(diǎn)】目前，在枇杷的花[16-17]、果肉[18-19]、果皮[20]等組織的揮發(fā)性物質(zhì)定量上，多采用峰面積歸一法;內(nèi)標(biāo)法采用極少，可供選擇內(nèi)標(biāo)物單一，僅見(jiàn)辛醛[21]。關(guān)于環(huán)己酮的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用HS-SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)，設(shè)置4個(gè)不同的內(nèi)標(biāo)物（環(huán)己酮）濃度，進(jìn)行新白8號(hào)枇杷果肉香氣物質(zhì)定性定量檢測(cè)和比較分析，以期確定適宜的內(nèi)標(biāo)濃度，為枇杷果實(shí)香氣物質(zhì)的測(cè)定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用白肉枇杷品種新白8號(hào)，采自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)（福州）枇杷圃。6月上旬果實(shí)完熟期，從3株樹(shù)上采取成熟度和大小基本一致的果實(shí)，立即拿回試驗(yàn)室隨機(jī)混合，快速剝離果肉，撕成小塊，投入液氮，用錫鉑紙包住，置于-80℃超低溫冰箱保存待用。

1.2 內(nèi)標(biāo)配置

將分析純級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)己酮（質(zhì)量濃度為 0.947 g·mL-1，中國(guó)西亞化工股份有限公司）分別稀釋×1倍、×10倍、×100倍、×1 000倍（質(zhì)量濃度依次為947、94.7、9.47、0.947 μg·μL-1）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

予華DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣器（美國(guó) Supelco 公司）;50/30 μm DVB/CAR /PDMS 萃取頭（美國(guó)Supelco公司），使用前充分老化;Agilent 7980 N/5975GC-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）。

1.4 試驗(yàn)步驟

試驗(yàn)方法根據(jù)胡文舜等[22]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。

樣品前處理：果肉用研缽快速研磨成漿，分別稱(chēng)取9.00 g裝至有3.00 g NaCl密封頂空瓶中，加入3 mL超純水和不同濃度的環(huán)己酮溶液1 μL，放入轉(zhuǎn)子后旋緊瓶塞，在恒溫加熱磁力攪拌器（T=37℃，轉(zhuǎn)速=40 r·min-1）中進(jìn)行平衡15 min。將老化后的萃取頭插入樣品瓶的頂空位置，保持纖維頭距液面約1. 5 cm，調(diào)整轉(zhuǎn)速=20 r·min-1，頂空吸附35 min。將萃取垂直插入進(jìn)樣口后推入纖維頭，解析5 min。

GC-MS分析：氣相色譜條件和質(zhì)譜條件見(jiàn)蔣際謀等[23]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將采集到的質(zhì)譜圖通過(guò)MAD5975/增強(qiáng)型化學(xué)工作站和NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，根據(jù)匹配系數(shù)>70，或者匹配系數(shù)>40且前三項(xiàng)一致，篩選后，根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)及相關(guān)資料核實(shí)確定各種化學(xué)成分。采用峰面積歸一法計(jì)算峰面積比;參照吳霏霏等[21]的計(jì)算公式計(jì)算各成分相對(duì)含量f （ng·g-1），并略做改動(dòng)：

式中：Mi為待測(cè)化學(xué)成分的峰面積;c為環(huán)己酮濃度（μg·μL-1）;V為加入環(huán)己酮體積（1μL）;As為環(huán)己酮的峰面積;9為果肉質(zhì)量9 g;1 000為單位轉(zhuǎn)換。采用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 新白8號(hào)枇杷果實(shí)香氣成分分析

枇杷果肉揮發(fā)性成分SPME-GC /MS掃描總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。經(jīng)對(duì)各個(gè)組分?jǐn)?shù)據(jù)分析，新白8號(hào)枇杷果實(shí)中共檢測(cè)出10類(lèi)（酯類(lèi)、醚類(lèi)、醇類(lèi)、烷烴、芳香烴、酮類(lèi)、酸、醛類(lèi)、酚類(lèi)及其他），43種香氣化合物。其中，×1環(huán)己酮下未檢測(cè)出酚類(lèi)物質(zhì)，×100環(huán)己酮下檢測(cè)出最多的香氣物質(zhì)（表1）。其他條件一致情況下，不同的內(nèi)標(biāo)濃度下同一物質(zhì)的相對(duì)含量不同，同一內(nèi)標(biāo)濃度下的主要香氣成分也不同。

2.2 不同內(nèi)標(biāo)濃度下的枇杷果實(shí)GC/MS色譜圖分析

2.2.1 ×1環(huán)己酮的色譜圖分析 該樣品共檢測(cè)出30種有效香氣成分，有效峰面積比為38.20%，環(huán)己酮的峰面積比為47.38%。經(jīng)公式（1）計(jì)算，8種相對(duì)含量較高化合物分別是正丁基環(huán)己烷（19 873.41 ng·g-1）、對(duì)二甲苯（17 089.28 ng·g-1）、正戊基環(huán)己烷（15 890.51 ng·g-1）、2-庚酮（8 144.71 ng·g-1）、（E）-2-己烯醛（7 896.42 ng·g-1）、己醛（4 908.29 ng·g-1）、苯乙烯（3 442.55 ng·g-1）、乙苯（2 264.31 ng·g-1），為主要香氣化合物。2.2.2×10環(huán)己酮的色譜圖分析 該樣品共檢出39種有效香氣成分，有效峰面積比28.49%，環(huán)己酮的峰面積比為58.55%。利用公式（1）計(jì)算，8種相對(duì)含量較高的化合物依次是（E）-2-己烯醛（1 569.74 ng·g-1）、己醛（1 295.02 ng·g-1）、2-庚酮（503.82 ng·g-1）、正丁基環(huán)己烷（278.97 ng·g-1）、正戊基環(huán)己烷（207.81 ng·g-1）、對(duì)二甲苯（249.82 ng·g-1）、（E）-2-己烯-1-醇（141.39 ng·g-1）、苯乙烯（111.46 ng·g-1），為主要香氣成分。2.2.3×100環(huán)己酮的色譜圖分析 該樣品共檢測(cè)出41種有效香氣化合物，其有效峰面積比為42.70%，環(huán)己酮的峰面積比為36.37%。由（1）式計(jì)算可得，9種相對(duì)含量較高的化合物依次是（E）-2-己烯醛（382.22 ng·g-1）、己醛（301.00 ng·g-1）、正丁基環(huán)己烷（156.65 ng·g-1）、正戊基環(huán)己烷（104.70 ng·g-1）、2-庚酮（65.10 ng·g-1）、（E）-2-己烯-1-醇（34.64 ng·g-1）、苯乙烯（20.67 ng·g-1）、甲酸環(huán)己酯（18.76 ng·g-1）、正己醇（17.66 ng·g-1），為主要成分。2.2.4×1 000環(huán)己酮的色譜圖分析 該樣品共檢測(cè)出32種有效香氣物質(zhì)，其有效峰面積比39.51%，環(huán)己酮峰面積比為25.86%。經(jīng)（1）式計(jì)算，7種相對(duì)含量較高的香氣成分分別是己醛（74.94 ng·g-1）、（E）-2-己烯醛（55.98 ng·g-1）、（E）-2-己烯-1-醇（5.32 ng·g-1）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（2.89 ng·g-1）、正己醇（2.94 ng·g-1）、2-庚酮（1.93 ng·g-1）、（E）-2-己烯酸（1.71 ng·g-1），為主要化合物。2.3 4種內(nèi)標(biāo)濃度下新白8號(hào)白肉枇杷不同類(lèi)別香氣成分分析

由表1、圖2可知，經(jīng)GC-MS檢測(cè)，在4種環(huán)己酮濃度下，枇杷果肉揮發(fā)性化合物主要有10類(lèi)，峰面積比較高的種類(lèi)由高到低依次為醛類(lèi)、烷烴、酮類(lèi)、芳香烴、醇類(lèi)化合物，其余種類(lèi)峰面積比均小于2.5%。其中，環(huán)己酮原液為內(nèi)標(biāo)時(shí)，烷烴類(lèi)峰面積比最高為41.88%，芳香烴、醛類(lèi)、酮類(lèi)和醇類(lèi)峰面積比分別為27.39%、16.39%、11.55%、0.91%，但未檢測(cè)出酚類(lèi)化合物。環(huán)己酮10倍液為內(nèi)標(biāo)時(shí)，醛類(lèi)物質(zhì)含量最高，其次依次為酮類(lèi)、烷烴、芳香烴、醇類(lèi)，峰面積比分別為57.92%、13.52%、9.59%、7.90%、6.99%。環(huán)己酮100倍液為內(nèi)標(biāo)時(shí)，醛類(lèi)物質(zhì)峰面積比最高為56.96%，其次為烷烴、酮類(lèi)、醇類(lèi)、芳香烴，其峰面積比依次為21.22%、7.61%、6.04%、4.05%。在環(huán)己酮1 000倍液濃度下，醛類(lèi)峰面積比仍最高為84.26%，但醇類(lèi)、酮類(lèi)、烷烴、芳香烴的峰面積比僅6.29%、2.39%、0.99%、0.38%。酯類(lèi)、酸類(lèi)、醚類(lèi)和其他等類(lèi)別，在不同內(nèi)標(biāo)濃度下，其峰面積比差異大。由此可見(jiàn)，其他條件相同情況下，內(nèi)標(biāo)濃度不同，主要香氣類(lèi)別的含量也有較明顯的差異。3 討論與結(jié)論

3.1 新白8號(hào)白肉枇杷果實(shí)的主要香氣物質(zhì)

新白8號(hào)具有較多優(yōu)良品質(zhì)，是有發(fā)展前景的晚熟白肉枇杷品種[3]。本研究選用4種濃度環(huán)己酮溶液為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)該品種進(jìn)行果實(shí)香氣成分的HS-SPME-GC/MS定性和定量分析比較，共鑒定出10類(lèi)43種香氣物質(zhì)，主要香氣類(lèi)別為酮類(lèi)（10種）、醇類(lèi)（8種）和醛類(lèi)（8種）、烷烴（3種）、芳香烴（3種）;己醛、（E）-2-己烯醛，正丁基環(huán)己烷、正戊基環(huán)己烷、2-庚酮、（E）-2-己烯-1-醇、苯乙烯等相對(duì)含量較高，為新白8號(hào)果實(shí)的主要香氣物質(zhì)。

在現(xiàn)有的同類(lèi)研究報(bào)道中，吳霏霏[21]采用SPME-GC/MS技術(shù)結(jié)合內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，從13種白肉枇杷品種果肉中共鑒定出7類(lèi)35種香氣成分，其中主要類(lèi)別是烴類(lèi)（12種）、醇類(lèi)（11種）、醛類(lèi)（5種）、醚類(lèi)（2種），主要香氣物質(zhì)有壬醛、葵醛、2-十六醇、1-二十二醇、alpha-柏木烯、β-紫羅酮等;梁乘榜[24]采用GC/MS法從12種白肉枇杷品種果肉中檢測(cè)出7類(lèi)34種香氣成分，其果實(shí)風(fēng)味主要來(lái)源是醛類(lèi)和醇類(lèi)，主要香氣物質(zhì)的是順-4-環(huán)戊烯-1，3-二醇、反式-2-甲基環(huán)戊醇、己醛和壬醛等。本試驗(yàn)所測(cè)得的香氣成分與二者研究共同存在的主要物質(zhì)有己醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯-1-醇，其他物質(zhì)有正己醇、甲基庚烯酮、β-紫羅酮、壬醛、葵醛、苯甲醛等，推測(cè)這些化合物為白肉枇杷的共同香氣物質(zhì);而正丁基環(huán)己烷、正戊基環(huán)己烷、2-庚酮、苯乙烯是以上研究所沒(méi)有的，推測(cè)為新白8號(hào)果肉的獨(dú)特香氣物質(zhì)。本研究測(cè)得新白8號(hào)枇杷果實(shí)香氣成分豐富多樣，這也證實(shí)了環(huán)己酮可以作為枇杷果實(shí)香氣成分測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物。

3.2 枇杷果實(shí)香氣成分GC/MS檢測(cè)的適宜內(nèi)標(biāo)濃度

相同條件下，適宜的內(nèi)標(biāo)物及其濃度能檢測(cè)出較多的香氣成分，且各成分峰面積占比合理。本研究在947 μg·μL-1環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)的樣品中檢測(cè)出的香氣成分種類(lèi)和類(lèi)別最少;94.7 μg·μL-1環(huán)己酮中有效峰面積比最小且環(huán)己酮峰面積比過(guò)高;0.947 μg·μL-1環(huán)己酮中醛類(lèi)峰面積比過(guò)高。但在9.47 μg·μL-1環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)時(shí)，檢測(cè)出的香氣成分種類(lèi)最多（42種）、有效峰面積比最高（42.70%）、環(huán)己酮峰面積占比（36.37%）適宜。表明在4種環(huán)己酮濃度中，9.47 μg·μL-1為枇杷果實(shí)香氣成分固相微萃取的內(nèi)標(biāo)物最佳濃度。

吳霏霏[21]以0.082 1 g·L-1辛醛為內(nèi)標(biāo)，在白肉枇杷品種‘槐焚’果肉中測(cè)得己醛峰面積比為24.35%;‘山東雞蛋白’果肉中主要香氣類(lèi)別的峰面積比由高到低依次為醛類(lèi)56.71%、醇類(lèi)27.28%、烴類(lèi)8.85%、醚類(lèi)6.26%。本試驗(yàn)在9.47 μg·μL-1環(huán)己酮下，測(cè)得己醛峰面積比為24.36%;醛類(lèi)、烷烴、酮類(lèi)、醇類(lèi)、芳香烴的峰面積比分別為56.96%、21.21%、7.61%、6.04%、4.05%。這與吳霏霏的試驗(yàn)結(jié)果基本相符，表明在9.47 μg·μL-1環(huán)己酮下檢測(cè)出的香氣物質(zhì)峰面積比適宜。由此可見(jiàn)，9.47 μg·μL-1為枇杷果實(shí)香氣成分固相微萃取的內(nèi)標(biāo)物（環(huán)己酮溶液）的適宜濃度，有利于枇杷果實(shí)香氣物質(zhì)的HS-SPME-GC/MS檢測(cè)與分析。

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（責(zé)任編輯：黃愛(ài)萍）