熊果酸對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

鮮瑤瑤 周儉 曾光 王莘智 劉沙 徐豫湘

〔摘要〕 目的 研究熊果酸（ursolic acid，UA）對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collageninduced arthritis， CIA）大鼠關(guān)節(jié)X線及關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響。方法 SD大鼠采取皮下注射牛Ⅱ型膠原加弗氏不完全佐劑法建立CIA模型，取造模成功后大鼠隨機(jī)分為CIA模型組、UA低劑量組、UA高劑量組、甲氨喋呤（methotrexate， MTX）組、UA+MTX組并予以對應(yīng)干預(yù)。另取6只正常大鼠為對照的空白組。初次免疫30 d斷頸處死大鼠，關(guān)節(jié)行X線攝片，再取下大鼠炎癥關(guān)節(jié)組織勻漿，提取RNA，熒光定量PCR法檢測IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β的mRNA表達(dá)。結(jié)果 與CIA模型組相比，UA高劑量組、MTX組、UA+MTX組X線評(píng)分減低（P<0.05或P<0.01）;各治療組IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)降低（P<0.01或P<0.05）;各治療組IL-10、TGF-β因子的mRNA表達(dá)增高（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 UA可明顯緩解CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥，改善關(guān)節(jié)X線評(píng)分，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生，維持組織促炎因子與抑炎因子的平衡有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 熊果酸;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎;X線評(píng)分;炎癥因子

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R593.22? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of ursolic acid （UA） on the articular X-ray and mRNA expressions of joint inflammation-related factors in collagen-induced arthritis （CIA） rats. Methods SD rats were given subcutaneous injection of bovine type II collagen plus Freund's incomplete adjuvant for modeling. After successful modeling， the rats were randomly divided into a CIA model group， a UA low-dose group， a UA high-dose group， a methotrexate （MTX） group and a UA + MTX group and they were given corresponding intervention. Another 6 normal rats were selected as the control group. Rats were sacrificed by neck breaking after 30 d of primary immunization， and the joints were taken X-ray. The tissue homogenate of rat's inflammatory joint was removed and RNA was extracted. The expressions of IL-17A， IL-10， IL-6， TNF-α， IL-1β， TGF-β and mRNA were detected by fluorescence quantitative PCR. Results Compared with the CIA model group， the X-ray scores of the UA high-dose group， the MTX group， and the UA + MTX group were decreased （P<0.05 or P<0.01）; the mRNA expressions of IL-17A， IL-6， TNF-α and IL-1β in each treatment group were decreased （P<0.01 or P<0.05）; the mRNA expressions of IL-10 and TGF-β in each treatment group were increased （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion UA can significantly alleviate joint inflammation in CIA rats and improve the articular X-ray score. The mechanism may be related to regulating the production of inflammatory factors and maintaining the balance between tissue pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors.

〔Keywords〕 ursolic acid; rheumatoid arthritis; collagen-induced arthritis; X-ray score; inflammatory factor

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床特征的慢性自身免疫性疾病，其基本病理改變?yōu)榛ぱ住⒀荇栊纬?，可侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊破壞。隨著病程的進(jìn)展，RA患者殘疾和功能受限發(fā)生率升高[1]，及早發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行干預(yù)治療，延緩患者病情進(jìn)展以及減輕患者痛苦，具有重要意義。RA的西醫(yī)發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前多采用非甾體類抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs， NSAIDs）聯(lián)合改善病情的抗風(fēng)濕藥物（disease modifying anti-rheumatic drugs， DMARDs）治療，長期使用不良反應(yīng)較多。從傳統(tǒng)中藥中尋找和開發(fā)高效、低毒的抗風(fēng)濕新藥是臨床的迫切需求。

熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏蘇酸、烏索酸，主要存在女貞子、山楂、陸英、夏枯草、車前草、白花蛇舌草、連翹、苦丁茶、甘草、連翹等藥用植物中，在夾竹桃、連翹葉、枇杷葉和白花蛇舌草中UA的含量最高[2]。研究表明UA具有廣泛而溫和的抗炎[3]、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)、保護(hù)胃黏膜和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[4-5]，UA也顯示出抗抑郁、心臟保護(hù)、腎保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、胃腸保護(hù)、平喘、抗激素、抗關(guān)節(jié)炎和抗誘變作用[3]。RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collageninduced arthritis， CIA）是最經(jīng)典應(yīng)用最廣泛的RA模型復(fù)制方法[6]，本實(shí)驗(yàn)通過大鼠CIA模型來研究UA對關(guān)節(jié)炎影響，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 動(dòng)物? SPF級(jí)健康SD大鼠，8周齡，雌性，體質(zhì)量（120±10）g，購于斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK（湘）2018-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11400700151972;飼養(yǎng)處及實(shí)驗(yàn)基地：湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，正常飼養(yǎng)一周后實(shí)驗(yàn)。

1.1.2? 試劑? 牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex，貨號(hào)：20021）;弗氏不完全佐劑（Sigma，批號(hào)：BJ-012-0392）;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），Delta標(biāo)準(zhǔn)品公司提供，貨號(hào)：110742，采用二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁，貨號(hào)：D103283）溶解;甲氨喋呤（methotrexate， MTX）注射液（規(guī)格：5 mg/支，山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào)02180101）;RNA提取液trizol（Invitrogen，貨號(hào)：15596018）。引物：生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR Mix試劑盒（立陶宛Fermentas）。

1.1.3? 儀器? MF-150G型Digital Diagnose X線片攝片機(jī)（美國BENNETT公司）;7500PCR儀（美國ABI）;T10 basic勻漿機(jī)（德國IKA）。

1.2? 方法

1.2.1? 造模與評(píng)估? 取70只雌性SD大鼠，隨機(jī)取6只作為正常對照組（空白組），其余大鼠均復(fù)制CIA模型[7]，將溶于醋酸的牛Ⅱ型膠原（濃度為2 mg/mL）與弗氏不完全佐劑（IFA）等體積混合，充分乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑（1 mg/mL）。在無菌條件下，于大鼠尾根部皮下注射（0.2 mL/只）配制好的Ⅱ型膠原乳劑，初次免疫當(dāng)天作為0 d，第7天按上述方法、相同劑量（0.2 mL/只）加強(qiáng)1次。空白組注射等體積的生理鹽水。用關(guān)節(jié)炎指數(shù)作為判斷模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。肢體關(guān)節(jié)腫脹按0-Ⅳ級(jí)評(píng)分：0，無紅腫;Ⅰ，趾關(guān)節(jié)稍腫;Ⅱ，趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹;Ⅲ，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹;Ⅳ，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。AI值=四肢肢體關(guān)節(jié)腫脹級(jí)評(píng)分之和（Ⅰ級(jí)為1分，總分為16分）。AI≥4分為造模成功，本次成功率70%（于初次免疫12 d時(shí)造模成功）。

1.2.2? 分組與干預(yù)? 將造模成功的CIA大鼠隨機(jī)分為CIA模型組、UA低劑量組、UA高劑量組、MTX組、UA+MTX組，每組各6只。在初次免疫12 d時(shí)，UA低劑量組給予每天50 mg/kg灌胃，UA高劑量組給予每天100 mg/kg灌胃，MTX組每3天給予1 mg/kg灌胃，UA+MTX組予以每天UA 50 mg/kg、每3天予以MTX 1 mg/kg灌胃，空白組和CIA模型組大鼠分別給予等體積生理鹽水灌胃。每天觀察大鼠進(jìn)食、大小便、精神狀態(tài)及一般活動(dòng)情況。于初次免疫30 d斷頸處死大鼠，四肢行X線攝片，再取下大鼠炎癥的后足進(jìn)行研究。

1.3? 觀察指標(biāo)

1.3.1? 關(guān)節(jié)炎X線評(píng)分[8]? X線評(píng)分從軟組織腫脹、骨侵蝕和關(guān)節(jié)間隙改變3個(gè)方面綜合進(jìn)行評(píng)價(jià)。初次免疫30 d時(shí)將各組大鼠的四肢關(guān)節(jié)置X線成像系統(tǒng)下攝片（湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科）進(jìn)行X線評(píng)分計(jì)分。

1.3.2? 大鼠關(guān)節(jié)軟組織中炎癥相關(guān)分子IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β因子的mRNA表達(dá)檢測? 于初次免疫30 d，取大鼠炎癥的后足，組織勻漿，按說明書提取各組RNA。使用Nanodrop2000檢測RNA濃度及純度，將濃度過高的RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，使其終濃度為500 ng/μL。按照RT-RCR試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，各引物序列見表1。取上述反應(yīng)產(chǎn)物2.0 μLcDNA。配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管：2×qPCR Mix

12.5 μL;上游引物2.0 μL;下游2.5 μL;ddH2O8.0 μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃10 min;循環(huán)（40次）95 ℃15 s→60 ℃60 s;熔解曲線，65 ℃→95 ℃，每15秒升溫0.3 ℃。在美國ABI7500熒光定量擴(kuò)增儀上完成熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增，作出溶解曲線，收集熒光得到的曲線圖，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析程序分析。ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待測樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本），B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本），K=A-B（mean），表達(dá)水平以2-ΔΔCT表示。

1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用“x±s”表示，行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? UA 對CIA 大鼠的關(guān)節(jié)X線評(píng)分的影響

CIA模型組大鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，足趾各關(guān)節(jié)空隙狹窄且模糊關(guān)節(jié)變形，關(guān)節(jié)X線評(píng)分增高。與空白組相比，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)X線評(píng)分明顯增高（P<0.01）。與CIA模型組相比，UA高劑量組X線評(píng)分降低（P<0.05），MTX組、UA+MTX組大鼠關(guān)節(jié)X線評(píng)分明顯降低（P<0.01）。與MTX組相比，UA低劑量組大鼠關(guān)節(jié)X線評(píng)分較高（P<0.05），見圖1-2。

2.2? UA對CIA大鼠關(guān)節(jié)軟組織炎癥相關(guān)分子IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β因子的mRNA表達(dá)影響

與空白組相比，CIA模型組IL-6表達(dá)較高（P<0.05），IL-17A、TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯增高（P<0.01），抑炎因子TGF-β、IL-10表達(dá)明顯降低（P<0.01）。與CIA模型組相比，UA低劑量組IL-17A、TNF-α、IL-1β降低（P<0.05）;UA高劑量組IL-6、IL-17A、TNF-α、IL-1β降低（P<0.05），抑炎因子TGF-β、IL-10表達(dá)升高（P<0.05）;MTX組IL-6、IL-1β表達(dá)降低（P<0.05），IL-17A、TNF-α表達(dá)明顯降低（P<0.01），抑炎因子TGF-β升高（P<0.05）、IL-10明顯升高（P<0.01）;UA+MTX組IL-6表達(dá)降低（P<0.05），IL-17A、TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯降低（P<0.01），IL-10表達(dá)升高（P<0.05），TGF-β明顯升高（P<0.01）。與MTX相比，UA+MTX組TGF-β1表達(dá)升高（P<0.05），UA低劑量組IL-17A明顯增高（P<0.01）。見表2。

3 討論

RA臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、變形，滑膜持續(xù)炎癥致骨骼破壞及軟骨降解為特征[9]，炎癥細(xì)胞因子激活破骨細(xì)胞是局部骨破壞的重要原因之一[10]。目前RA的致病原因尚未十分明確，故而無法采取針對性的根治措施。臨床治療的主要目標(biāo)是緩解關(guān)節(jié)癥狀，控制病情進(jìn)展，防止關(guān)節(jié)殘疾的發(fā)生，從而改善生活質(zhì)量，但無法做到根除。CIA模型能顯示RA的慢性病變特征如關(guān)節(jié)滑膜增生、軟骨和骨破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，是研究人類RA的理想模型。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，UA能明顯抑制體外T細(xì)胞激活與增殖[11]，降低Th17，升高Treg，維持Th17/Treg平衡[12-13]，UA體內(nèi)給藥100 mg/kg一周，明顯減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)的病理改變，減少大鼠關(guān)節(jié)中TNF-a、IL-17和PGE2的表達(dá)[14]。UA能明顯抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，抑制關(guān)節(jié)滑膜組織增生，減輕關(guān)節(jié)的病理改變，改善骨質(zhì)破壞[15]。

基于UA的抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。推測UA能夠調(diào)節(jié)RA的免疫性炎癥。本文復(fù)制CIA模型，研究UA對實(shí)驗(yàn)性RA大鼠關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)因子及關(guān)節(jié)X線評(píng)分影響，發(fā)現(xiàn)UA（100 mg/kg·d）給藥能降低CIA關(guān)節(jié)X線綜合評(píng)分，減少炎癥因子IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-1β因子的mRNA表達(dá)，升高抑炎因子IL-10、TGF-β因子的mRNA表達(dá)。MTX是目前治療RA的基礎(chǔ)性藥物，其作用是抑制二氫葉酸還原酶以及甲?；D(zhuǎn)移酶的活性，具有免疫抑制以及迅速的抗炎作用[16]。以MTX為基礎(chǔ)的多種抗風(fēng)濕藥物的聯(lián)合使用是臨床研究的主要方向。UA來源廣范，生物活性多，本實(shí)驗(yàn)研究表明UA可以改善CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，緩解CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥損傷，調(diào)節(jié)炎癥因子在關(guān)節(jié)組織中的表達(dá)及改善關(guān)節(jié)X線評(píng)分，具有炎癥的作用，作為一種有潛力的高效、低毒的中藥炎癥調(diào)節(jié)劑值得深入研究。

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