柚皮素治療結(jié)直腸癌的網(wǎng)絡藥理學分析及實驗驗證*

張子函，李文鑫，羅香蓉，熊祖明，林益镕，張 森

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，南寧 530021）

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在2021年美國男性及女性的新發(fā)癌癥中均排在第3 位，在致死的惡性腫瘤中也排在第3 位[1]。早期結(jié)直腸癌主要通過手術來達到治療目的，但是一旦進展到晚期則主要通過化療與靶向治療使疾病緩解。但部分患者對目前臨床廣泛使用的化療藥產(chǎn)生耐藥，迫切需要研發(fā)新的治療藥物。柚皮素是一種廣泛存在于柑橘類水果中的黃酮成分，先前的研究已經(jīng)證實，柚皮素具有一定的抗腫瘤作用[2-3]。但是柚皮素是否具有抗結(jié)直腸癌腫瘤的作用以及其可能的作用機制尚未見相關報道。本文運用網(wǎng)絡藥理學的方法探究柚皮素作用于結(jié)直腸癌產(chǎn)生的作用及其機制，并通過實驗進一步驗證柚皮素對結(jié)直腸癌細胞的抑制作用及核心基因表達的改變。

1 材料與方法

1.1 篩選柚皮素的作用靶點

柚皮素是在許多植物中都存在的化合物，在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索柚皮素（naringenin），保存它的3D 格式并上傳至pharmmapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）數(shù)據(jù)庫中得到柚皮素的主要藥效團和其作用的靶點。同時利用SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫獲得柚皮素的靶點基因，兩者取交集獲得最終作用靶點。

1.2 篩選結(jié)直腸癌的作用靶點

使用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），以“colorectal cancer”為關鍵詞檢索結(jié)直腸癌的作用靶點。同時使用DisGeNet 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/），以“colorectal cancer”為關鍵詞檢索結(jié)直腸癌的作用靶點。將兩個數(shù)據(jù)庫獲得的結(jié)直腸癌作用靶點合并后刪除重復項，獲得結(jié)直腸癌作用的最終靶點。

1.3 柚皮素治療結(jié)直腸癌的靶點

使用微生信在線網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/）中的jvenn 工具得到柚皮素作用靶點與結(jié)直腸癌靶點的交集，即柚皮素治療結(jié)直腸癌的作用靶點。

1.4 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建

將獲得的柚皮素治療結(jié)直腸癌的作用靶點上傳至STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“homo sapiens”得到PPI相互作用網(wǎng)絡，下載其TSV格式。經(jīng)過處理后將數(shù)據(jù)導入Cytoscape中，并利用cytoHubba找到柚皮素作用于結(jié)直腸癌的核心基因。

1.5 KEGG通路富集分析和GO富集分析

利用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對之前獲得的可能作用靶點進行GO富集分析和KEGG富集分析。再使用R包ggpolt2分別繪制P值最小的20 個分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）以及20條KEGG通路的條形圖。

1.6 實驗驗證

1.6.1 CCK-8 檢測柚皮素對結(jié)直腸癌細胞的作用

柚皮素購自上海源葉生物公司（貨號：B21596-20 mg）取對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌HCT116細胞，將細胞密度調(diào)整為5×104個/mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入含有不同濃度柚皮素的新鮮培養(yǎng)基100 μL，濃度梯度為：0.1%DMSO、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L。分別在37 ℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL的CCK-8試劑混勻后在培養(yǎng)箱中放置90 min，用酶標儀檢測450 nm波長時的吸光度并計算柚皮素對結(jié)直腸癌細胞增殖的抑制作用并繪制折線圖。

1.6.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測核心基因的mRNA 表達水平 柚皮素作用48 h 后各孔加入600 μL Trizol 裂解后提取總RNA，之后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 進 行PCR 擴增。反 應體系 為：cDNA 模 板2 μL，正向引物0.8 μL，反向引物0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqII 10 μL，ddH2O 6.4 μL。反應條件為：95 ℃，30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s重復45個循環(huán)。引物序列為：PIK3CA：上游：5’-CGGTGACTGTGTGGGACTTATTGAG-3’，下游：5’-TGTAGTGTGTGGCTGTTGAACTGC-3’；MET：上 游：ATCAGGAGGTGTTTGGAAAGAT-3’，下游：5’-CGACTGTATGTCAGCAGTATGA；ARK1C3-3’：上游：5’-AAGCTTTGGTCCACTTTTCATC-3’，下 游：5’-GGTCAACATAGTCCAATTGAGC-3’；HSD17B2：上游：5’-CTCGTTAGCCAGCAAGGACTTCTC-3’，下 游：5’-AGCAAGGCAGATCCACAAGTAAGC-3’；SNCA：上 游：5’-GACCAAAGAGCAAGTGACAAAT-3’，下游：5’-CAGAAGGCATTTCATAAGCCTC-3’；SRC：上游：5’-GGAGTGGTATTTTGGCAAGATC-3’，下 游：5’-GATCTTGTAGTGCTTCACGTTG-3’；ESR1：上游：5’-CCTCCTCATCCTCTCCCACATCAG-3’，下 游：5’-GCATCTCCAGCAGCAGGTCATAG-3’。實時熒光定量PCR的結(jié)果用相對定量法用2-ΔΔCT值來表示。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 軟件進行繪圖與統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素的潛在作用靶點預測

將通過PubChem獲得的柚皮素3D結(jié)構(gòu)上傳至pharmmapper 后獲得柚皮素作用的靶點，共70 個。同時通過SwissTargetPrediction 獲得100 個柚皮素的作用靶點。刪除重復項后，總共獲得169 個柚皮素作用靶點。

2.2 結(jié)直腸癌的靶點預測及共同靶點篩選

在GenCards 數(shù)據(jù)庫中檢索得到結(jié)直腸癌的10 422 個相關靶點，在DisGeNet 數(shù)據(jù)庫中得到5 473 個結(jié)直腸癌相關靶點，刪除重復項后共獲得11 247 個結(jié)直腸癌相關靶點。通過jvenn 工具繪制維恩圖（圖1），得到141 個交集靶點，即柚皮素治療結(jié)直腸癌可能的作用靶點。

圖1 柚皮素作用靶點與結(jié)直腸癌相關基因交集

2.3 PPI網(wǎng)絡分析及核心靶點預測

在STRING數(shù)據(jù)庫中導入之前獲得的141個交集靶點，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（圖2）。之后在CytoScape 中獲取柚皮素作用于結(jié)直腸癌的核心基因，即SRC、CBL、PIK3CA、SYK、LCK、VEGFA、HCK、KDR、SNCA、AKR1C3、HSD17B1、HSD17B2、CYP3A4、CYP19A1、PIK3CB、MET、IGF1R、ESR1、INSR、VAV3（圖3）。

圖2 柚皮素作用于結(jié)直腸癌的核心基因

圖3 PPI網(wǎng)絡

2.4 GO生物功能分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對之前獲得的柚皮素可能作用于結(jié)直腸癌的141 個交集靶點進行GO 生物功能分析和KEGG通路富集分析，獲得靶基因參與的信號通路和生物學過程。GO功能富集分析結(jié)果顯示，CC集中于細胞膜、血小板、肥大顆粒細胞、轉(zhuǎn)移酶復合物等（圖4A）。MF 主要集中于碳酸鹽脫水酶、蛋白酪氨酸激酶、水解酶等多種酶的活性，以及類固醇激素受體活性，類固醇結(jié)合，核受體、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性，激素結(jié)合等（圖4B）。BP 主要集中于蛋白質(zhì)自磷酸化，肽基酪氨酸的磷酸化及修飾，對淀粉樣蛋白-β的反應，對類固醇激素的反應，MAP 激酶活性的正相關性及活性，異生物代謝過程，生殖結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育等（圖4C）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、前列腺癌（prostate cancer）、Ras 信號通路（ras signaling pathway）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、Rap1 信號通路（Rap1 signaling pathway）、化學致癌作用—受體激活（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、粘著力（focal adhesion），膀胱癌（bladder cancer）、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、催乳素信號通路（prolactin signaling pathway）、卵巢類固醇生成（ovarian steroidogenesis）、乳腺癌（breast cancer）、黑色素瘤（breast cancer）、非小細胞肺癌（Nonsmall cell lung cancer）、亞油酸代謝（linoleic acid metabolism）等是柚皮素的主要作用通路（圖4D）。由此可見，柚皮素對于結(jié)直腸癌可能具有一定的抑制作用。

圖4 GO分析和KEGG通路富集分析

2.5 實驗驗證

2.5.1 CCK-8 檢測柚皮素對結(jié)直腸癌細胞的抑制作用 在柚皮素濃度為50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L時，24 h的抑制率分別為6.12%、11.37%、26.16%、59.78%、81.43%；48 h 的抑制率分別為15.01%、30.37%、45.04%、85.50%、87.61%；72 h 的抑制率分別為14.35%、47.31%、69.28%、93.26%、91.03%。隨著柚皮素濃度的上升和作用時間的延長，柚皮素對結(jié)直腸癌的抑制作用逐漸增強（P＜0.05），見圖5。

圖5 柚皮素對結(jié)直腸HCT116細胞增殖的抑制作用

2.5.2 RT-qPCR檢測核心基因的mRNA表達水平

給予200 μmol/L的柚皮素之后,與對照組相比，柚皮素處理過的細胞內(nèi)PIK3CA、MET、HSD17B2、SNCA、SRC、ESR1mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；而ARK1C3mRNA 表達水平升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 柚皮素對核心基因mRNA表達水平的影響

3 討論

有研究認為陳皮、半夏、草豆蔻、甘草中的主要抗腫瘤成分為柚皮素[4-6]。柚皮素是天然二氫黃酮類化合物，研究顯示其可通過抑制細胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用，如在HepG2肝癌細胞和人胎盤絨毛膜癌中[7-8]。同時，它也可通過誘導HepG2 肝癌細胞、胰腺癌等細胞凋亡而抑制腫瘤生長[7，9]。柚皮素還可以抑制腫瘤細胞的侵襲遷移，如在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞[2]、乳腺癌細胞[10]和前列腺癌細胞中[3]。但柚皮素在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的抗腫瘤作用及其機制目前的研究相對較少。

通過網(wǎng)絡藥理學分析顯示，PIK3CA、SRC、HSD17B2、SNCA、CYP19A1、PIK3CB、INSR、MET、ESR1、ARK1C3等為柚皮素治療結(jié)直腸癌的核心基因。其中，SRC在超過80%的結(jié)直腸癌患者中異常過度表達和激活，柚皮素作用于SRC基因就可能發(fā)揮其抗結(jié)直腸腫瘤作用[11]。MET 也稱為肝細胞生長因子受體，是一種酪氨酸激酶，被認為是結(jié)直腸癌早期侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素，可作為重要的預后指標[12]。研究顯示，激活MET可以誘導結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]，同時，MET 也參與了癌細胞的免疫逃逸[13]。提示柚皮素可能通過作用于MET 基因抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，改善患者預后。另有研究顯示，ESR1 的表達與結(jié)直腸癌細胞對五氟尿嘧啶的敏感性呈負相關[14]，柚皮素降低ESR1的表達可能會增高結(jié)直腸癌細胞對于化療藥物的敏感性從而達到更好的治療效果。SNCA基因被證實與胃腸道腫瘤存在一定的關系[15]，柚皮素作用于這一基因可能對結(jié)直腸癌產(chǎn)生一定的影響。

本研究通路富集結(jié)果顯示，PI3K-Akt信號通路是柚皮素抗結(jié)直腸癌可能發(fā)揮作用的通路，PIK3CA在結(jié)直腸癌組織中的表達高于正常腸上皮組織[16]，PI3K-Akt信號通路與結(jié)直腸癌相關，先前的研究證實了PI3K-Akt 信號通路可以作為結(jié)直腸癌的治療靶點[17-18]。同時，柚皮素可作用于催乳素信號通路，卵巢類固醇生成信號通路，乳腺癌信號通路，而這些通路都與體內(nèi)雌激素相關。柚皮素可能通過作用于雌激素受體而發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。而花生四烯酸代謝、亞油酸代謝通路是體內(nèi)的脂代謝通路，柚皮素也可能通過改變脂肪組織而發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。

CCK-8實驗顯示，柚皮素對結(jié)直腸癌細胞的生長具有抑制作用。同時RT-qPCR實驗顯示，結(jié)直腸癌細胞經(jīng)過柚皮素處理后核心基因PIK3CA、SRC、HSD17B2、MET、ESR1和ARK1C3的表達量會發(fā)生顯著性改變，進一步表明柚皮素通過靶向這些基因產(chǎn)生抗結(jié)直腸癌作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法，預測了柚皮素的抗結(jié)直腸癌作用及其可能的作用機制，通過實驗驗證了柚皮素對結(jié)直腸癌細胞具有抑制作用并使核心基因在結(jié)直腸癌細胞中的表達情況改變，可為后續(xù)柚皮素治療結(jié)直腸癌的進一步研究提供理論依據(jù)。