乙?；?11-酮-β-乳香酸對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的作用

何明為 姚軍 韋慶軍

摘要：目的：觀察乙?；?11-酮-β-乳香酸（AKBA）對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和表型維持的影響。方法：取3天齡的SD乳鼠的軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。利用MTT法檢測AKBA對細(xì)胞的毒性作用;設(shè)置空白組和低、中和高濃度AKBA藥物組;番紅O觀察AKBA對軟骨細(xì)胞分泌糖胺聚糖（GAG）的影響;qRT-PCR分析AKBA干預(yù)對軟骨特異性基因表達(dá)的影響。結(jié)果：低、中和高濃度AKBA組對細(xì)胞增殖、軟骨特異性基因相對表達(dá)量均明顯高于空白組（P均<0.05），尤以中濃度組促進(jìn)作用最顯著。結(jié)論：AKBA具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用，可作為潛在的治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

關(guān)鍵詞：乙酰基-11-酮-β-乳香酸;骨關(guān)節(jié)炎;關(guān)節(jié)軟骨;增殖

【中圖分類號】R-3 ???【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ???【文章編號】2107-2306（2019）06-015-02

乙?；?11-酮-β-乳香酸（Acetyl-11-keto-β-boswellic acid， AKBA）是一種從乳香樹膠樹脂中提取出的有效活性化合物。有研究表明，作為一種藥物化合物，AKBA曾被用于治療炎癥[1]、潰瘍[2]和癌癥[3]等疾病;AKBA還可改善膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis， OA）患者疼痛、僵硬和功能[4]。然而，AKBA對OA的作用機(jī)制尚不清楚?；贏KBA對軟骨細(xì)胞具有保護(hù)及促進(jìn)增殖作用的假設(shè)，本研究旨在探討AKBA對軟骨細(xì)胞增殖和軟骨特異性基因表達(dá)的影響，為研究AKBA對OA的治療作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與統(tǒng)計(jì)方法

1.1 材料

藥物購于MedChenExpress （MCE）公司（https：//www.medchemexpress.cn/AKBA.html），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1A所示。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（高糖）、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、MTT細(xì)胞毒性試劑盒和番紅O染色試劑盒購于北京索來寶科技有限公司，RT-PCR試劑盒購于上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司，胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。

1.2 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)以（`x ± s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性意義。

2方法與結(jié)果

2.1 AKBA對SD乳鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖作用的影響

為檢測AKBA對SD乳鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖作用的影響，取出生3日齡的乳鼠原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)至第三代。將軟骨細(xì)胞接種于96孔板，每孔5000個(gè)細(xì)胞，置于恒溫培養(yǎng)箱中過夜。第二天加入含有不同濃度AKBA的培養(yǎng)基，分別干預(yù)3天。之后向每孔培養(yǎng)基中加入20μL的MTT，繼續(xù)在恒溫箱中孵育4小時(shí)后將多余培養(yǎng)基吸走，加入200μL DMSO并在黑暗條件下孵育15分鐘。最后用Multiskan GO微板分光光度計(jì)在570nm處測定光密度值。如圖1B所示，AKBA在小于40μM 時(shí)對軟骨細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，尤其在6.25 μM時(shí)，促細(xì)胞增殖作用達(dá)到最高。

2.2細(xì)胞爬片染色

為觀察AKBA作用于軟骨細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖（GAG）的分泌情況，我們對細(xì)胞生長爬片進(jìn)行了番紅O染色。將第三代軟骨細(xì)胞接種于鋪有細(xì)胞爬片的24孔板中，每孔10000個(gè)細(xì)胞，置于恒溫培養(yǎng)箱中過夜后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞，將每塊孔板隨機(jī)分為4組（空白對照組、低濃度組（1.5 μM）、中濃度組（6.25 μM）和高濃度組（25 μM）），每組6個(gè)孔，共24孔。待藥物干預(yù)滿三天后終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞爬片30分鐘，之后進(jìn)行按照染色試劑盒上的說明書進(jìn)行操作。染色結(jié)果如圖2所示，在AKBA干預(yù)3天后，中濃度（6.25 μM）組的細(xì)胞數(shù)量最多，同時(shí)紅染面積也越大。表明AKBA能促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌GAG，對有體外二維培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。

2.3 AKBA對軟骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的影響

為分析AKBA對軟骨細(xì)胞特異性基因的影響。將第三代軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中過夜后，分別加入含有低（1.5 μM）、中（6.25 μM）和高（25 μM）濃度的AKBA培養(yǎng)基，繼續(xù)干預(yù)3天。隨后采用RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞II型膠原（）和聚蛋白多糖（）的mRNA擴(kuò)增水平，并通過分析比較各個(gè)基因的表達(dá)情況。本研究所用引物如下：（上游：GTCCTACAATGTCAGGGCCA;下游：ACCCCTCTCTCCCTTGTCAC）;（上游：GAATGGGAGCCAGCCTACAC;下游：GAGAGGCAGAGGGACTTTCG）;（上游：TCCAGTATGACTCTACCCACG;下游：CACGACATACTCAGCACCAG）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3顯示，加入AKBA后軟骨特異性基因和明顯都得到上調(diào)（p<0.05），尤其是中濃度（6.25 μM）組上調(diào)效果最明顯。

3討論

據(jù)了解，OA是關(guān)節(jié)炎中最常見的一種類型，已被認(rèn)為是影響全世界數(shù)十億人的疾病之一，其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨慢性退行性變，關(guān)節(jié)疼痛，關(guān)節(jié)功能紊亂等[5]。關(guān)節(jié)軟骨作為一種再生能力較差的組織，在疾病、衰老或創(chuàng)傷的影響下，容易在結(jié)構(gòu)上發(fā)生破壞或退化，從而導(dǎo)致OA的發(fā)生發(fā)展。在OA進(jìn)展過程中，包括促炎因子（如MMP13、IL6和ADAMTS4等）在內(nèi)的分解代謝因子被激活，誘導(dǎo)軟骨逐漸自我破壞，影響了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成和分泌，進(jìn)而加深加快OA的嚴(yán)重程度[6]。因此，發(fā)掘具有軟骨保護(hù)作用和維持軟骨細(xì)胞功能的藥物能為OA的治療提供新的思路。

AKBA，是乳香酸類植物的主要成分，具有多種生物學(xué)活性，包括抗炎、抗病毒、抗癌作用等。以往有研究報(bào)道，AKBA可改善OA患者疼痛、僵硬和功能，然而，其作用機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們通過觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和表型維持來檢測AKBA的作用。該研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AKBA干預(yù)3天后，低、中、高濃度的三組AKBA均對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖能力的產(chǎn)生促進(jìn)作用;通過評估番紅O染色發(fā)現(xiàn)，AKBA在維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌GAG方面有明顯的效果，尤其在6.25 μM時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用最顯著。有研究表明，在軟骨細(xì)胞去分化后，和的表達(dá)會減少[7]，而本研究通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，AKBA治療后和表達(dá)不減反升，提示AKBA可能具有抑制軟骨細(xì)胞的去分化的作用。

綜上所述，本研究證實(shí)AKBA對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和功能方面有積極作用。結(jié)果提示AKBA可促進(jìn)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和維持其表型，可能成為治療OA軟骨損傷的潛在治療藥物。

參考文獻(xiàn)：

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基金項(xiàng)目：廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSW2019109）