雞傳染性支氣管炎病毒血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

李 倩

青海民族大學(xué)預(yù)科教育學(xué)院,青海 西寧 810000

0 引言

雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的致病性比較強(qiáng),且傳播范圍廣,傳染速度快,不僅會(huì)對(duì)雞的呼吸道和消化道產(chǎn)生極其嚴(yán)重的損害,還會(huì)對(duì)雞群的生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響,嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。此外,病毒還會(huì)對(duì)繁殖系統(tǒng)產(chǎn)生損害,使輸卵管永久性的退化。因IBV血清型別較多,且各血清型別之間缺少有效的相互防護(hù),新毒株產(chǎn)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)IBV的免疫力降低。為尋找快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,從血清學(xué)和分子生物學(xué)方面進(jìn)行研究,是防控雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)的重要研究?jī)?nèi)容。

1 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1.1 常用檢測(cè)技術(shù)及其方法比較

1.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法操作步驟比較簡(jiǎn)單,對(duì)于病毒的檢測(cè)比較準(zhǔn)確。從1971年Engvall等人創(chuàng)立了 ELISA技術(shù)后,ELISA因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、快速而被廣泛用于各種動(dòng)物病的診斷與免疫分析。美國(guó)、英國(guó)、日本在該技術(shù)的使用方面比較先進(jìn),都有相應(yīng)的商業(yè)測(cè)試工具。在我國(guó)已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),利用免疫層析技術(shù),將整個(gè)病毒包裹在一塊反應(yīng)盤上,用間接 ELISA法對(duì)雞群進(jìn)行檢測(cè)。莊金秋 等[1]利用微分離心-非連續(xù)濃度梯度蔗糖離心-瓊脂糖凝膠層析法,既能保證核酸質(zhì)量,又能減少由于蔗糖濃度梯度導(dǎo)致的核酸丟失,從而增強(qiáng)核酸酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的可信度。

1.1.2 病毒中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)(virus neutralization,VN)主要針對(duì)雞胚進(jìn)行使用,采用氣道環(huán)法,是一種在早期使用的鑒定方法,能夠?qū)BV進(jìn)行檢測(cè)。劉秀芹 等[2]利用氣道環(huán)切法,對(duì)山東地區(qū) IBV病毒的血清型別進(jìn)行了鑒別,并取得了較好的效果。盡管此法具有良好的敏感性和特異度,但是其存在步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻等缺點(diǎn)。

1.1.3 瓊脂擴(kuò)散沉淀法

瓊脂擴(kuò)散沉淀法(agar diffusion precipitation,AGP)是一種快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的方法,自從這一方法被提出后,在 IBV的血清學(xué)分析中得到了廣泛的使用。在雞群體中,病毒的陽性比率升高,表明存在 IBV的感染,可在此基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行抗體的配制。目前已有多種疫苗和疫苗的制備技術(shù),既能保持病毒的完整,又能增強(qiáng) AGP檢測(cè)的特異性。另外,用受感染的小雞的氣道分泌液作抗原,用 AGP與一種已知的抗體結(jié)合,可以發(fā)現(xiàn)分泌液中所含的病毒。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原是由雞胚胎中致命的博德特利菌系來生產(chǎn)的。

1.1.4 不同免疫狀態(tài)下3種血清檢測(cè)法的比較

對(duì)10只試驗(yàn)雞進(jìn)行第1次疫苗注射,20 d后采血進(jìn)行初免抗體檢測(cè),同時(shí)對(duì)這10只雞進(jìn)行第2次疫苗注射,20 d后采血進(jìn)行二免抗體檢測(cè)。對(duì)照組20只雞未進(jìn)行疫苗注射,在同時(shí)期采血作為陰性血清。

表1顯示出3種檢測(cè)方法檢測(cè)效果有區(qū)別,主要在于敏感性不同。ELISA法檢測(cè)一免、二免的雞血清中,血清中的血清學(xué)檢測(cè)陽性率均為100%;VN檢測(cè)結(jié)果顯示免疫組之間差別較大;在一免和二免2種抗體中,AGP的陽性率分別為0%和40%。

表1 不同免疫狀態(tài)下3種血清學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果比較

1.1.5 3種血清學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果之間一致性的計(jì)算

通過對(duì)3種方法進(jìn)行對(duì)比,得出了反映這3種方法兩兩之間相關(guān)性的Kappa值。在Kappa值為1時(shí),表明這2種方法的符合度是100%,而在Kappa值為0時(shí),表明這2種方法的符合度是0。從表2可以看出,ELISA與VN的Kappa值是0.69,ELISA與AGP之間的Kappa值是0.61,而VN與AGP之間的Kappa值是0.34,這2者之間的符合度是最低的。

表2 三種血清學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果之間 一致性的Kappa值的計(jì)算

1.2 其他血清檢測(cè)方法

1.2.1 血凝和血凝抑制試驗(yàn)

血凝試驗(yàn)(Hemagglutination test,HA)是一種靈敏、特異的檢測(cè)方法。蔡俊呈 等[4]研究表明,I-型磷酸酯酶 C 對(duì)IBV具有較強(qiáng)的凝血能力,且該凝血能力可被特異的抗血清阻斷。后來,研究者將這一理論進(jìn)行深入研究,提出了簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù),阿克賽德使它規(guī)范化。這一技術(shù)已被公認(rèn)為最有希望作為一種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來監(jiān)測(cè)產(chǎn)品中IB抗體含量的改變。已有研究表明,在IBV中,胰蛋白酶、卵磷脂酶C和乙醚等對(duì)7種血球有不同的凝集作用。IBV的血液凝聚能力與Na+、Mg2+有關(guān),0.5 mol/L的IBV蛋白的血液凝聚能力最強(qiáng),而甲醛對(duì) IBV蛋白的殺傷作用最強(qiáng)。

對(duì)于IBV的凝集作用,人們普遍認(rèn)為可能與其與IB病毒表面上的a-2,3位點(diǎn)上的半乳糖鏈相連所形成的一種唾液酸的結(jié)構(gòu)有關(guān)。血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibition test,HI)是臨床上使用較多的一種檢測(cè)方法。HI的檢測(cè)技術(shù)在養(yǎng)殖業(yè)使用更加切合實(shí)際,也更加節(jié)省時(shí)間和精力。然而,因?yàn)?HI抗原的制備過程非常繁瑣,還需要超速離心,而且要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的冷凍存。且需要根據(jù)病毒的濃度進(jìn)行使用,抗原具有不穩(wěn)定性,該種技術(shù)還沒有形成統(tǒng)一的使用規(guī)范,還有待于更多的改進(jìn)。

1.2.2 熒光抗體技術(shù)

熒光抗體技術(shù)(fluorescent antibody technology,FA)在IBV血清學(xué)診斷方面應(yīng)用比較多,也可以用于免疫學(xué)診斷。布勞恩赫公司第一個(gè)將螢光抗體技術(shù)用于雞群診斷檢測(cè),在感染了急性疾病的雞氣道上使用螢光標(biāo)記的抗體來偵測(cè)IBV。有研究者利用實(shí)驗(yàn)制備了抗原,對(duì)不同感染類型的雞進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在72 h內(nèi),人工感染的雞的腎中100%出現(xiàn)了特異的熒光,而在其他時(shí)候,也有一些雞出現(xiàn)了特異的熒光。經(jīng)人工接種后,所有病死雞的腎中都出現(xiàn)了100%的特異熒光;48～120 h在人工侵染的雞胚中100%出現(xiàn)特異的熒光。在178個(gè)天然感染的樣本中,有153個(gè)樣本的免疫反應(yīng)呈陽性,該技術(shù)檢測(cè)免疫反應(yīng)與傳統(tǒng)技術(shù)監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)的結(jié)果一致,且大大縮短了免疫反應(yīng)過程,適用于臨床診斷和疫苗免疫反應(yīng)的監(jiān)控。目前,FA被公認(rèn)為是一種簡(jiǎn)單、快速可靠、敏感度高、價(jià)格低廉的IBV診斷技術(shù)。

1.2.3 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層技術(shù)(GICA)是一種操作比較簡(jiǎn)單的方法,使用的時(shí)候不需要其他儀器的輔助,這種方法具有很好的開發(fā)價(jià)值,未來的使用前景較好。但該方法需要抗體的含量比較高,而且抗體都必須具有很好的活性。吳憶春[5]在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中,研制出了一種新型的 IBV免疫膠體金檢測(cè)試劑盒,該試劑盒可用于禽流感的早期檢測(cè)、預(yù)防和治療,并可對(duì)其他家禽呼吸系統(tǒng)疾病進(jìn)行快速檢測(cè)。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)是一種準(zhǔn)確度較高的檢測(cè)方法,可以對(duì)不同的病毒亞型進(jìn)行檢測(cè),對(duì)一種血清進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候,檢測(cè)結(jié)果不受其他亞型的影響。而且還可以針對(duì)一些差別很大的菌種,進(jìn)行特異性引物的篩選。對(duì)于突變頻率高的病毒,可以對(duì)其進(jìn)行血清型和基因分型;對(duì)于N、M等保守區(qū),可以對(duì)其進(jìn)行群體特異的擴(kuò)增。唐第深[6]以IBV的N區(qū)段為基礎(chǔ),通過設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR技術(shù),對(duì)IBV的N區(qū)段進(jìn)行了檢測(cè)。有研究者以IBV793/B毒株SI的基因序列為基礎(chǔ),通過RT-PCR技術(shù),對(duì)793/B毒株進(jìn)行了RT-PCR技術(shù)的研究。利用IBV強(qiáng)、弱毒疫苗毒株的序列特點(diǎn),通過對(duì)其S1基因多變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增出的基因片段能夠提升檢測(cè)的準(zhǔn)確性,這是一種復(fù)合鑒定技術(shù),是一種很好的技術(shù)診斷方式。

2.2 環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplifcation,RT-LAMP)是一種基于RT-PCR的快速、靈敏、新穎的核酸分析技術(shù),適用于養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)。有研究者以IBV M型株為研究對(duì)象,以RT-LAMP技術(shù)為基礎(chǔ),采用RT-PCR技術(shù)對(duì)IBV M型株進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明該技術(shù)對(duì)IBV M型株的檢出率高于RT-PCR,且特異性強(qiáng)、靈敏度高。研究者分別以5a+5b為參考,以M為參考,以N為參考,用RT-LAMP技術(shù)對(duì)IBV進(jìn)行了研究。

2.3 核酸探針技術(shù)

有研究者對(duì)IBV免疫后的雞支氣管內(nèi)IBV全基因組進(jìn)行了分析。在免疫后第1、3、9、14天時(shí),利用PCR方法對(duì)其進(jìn)行了擴(kuò)增,并通過熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行了定點(diǎn)雜交驗(yàn)證。核酸探針技術(shù)的應(yīng)用為病毒的檢測(cè)提供了新的方法,進(jìn)一步提升不同群體的檢測(cè)準(zhǔn)確度。在8個(gè)群體中,電子顯微鏡檢出4個(gè)群體,其中4個(gè)群體可用PCR法檢出。核酸探針技術(shù)用于N基因的檢測(cè)具有迅速特性,全部處理時(shí)間不大于12 h。在對(duì)該基因的檢測(cè)過程中,需要確定基因的位點(diǎn),N基因四位點(diǎn)構(gòu)建了一種BV-PCR快速測(cè)定方法。與 PCR擴(kuò)增法比較,2種試驗(yàn)均顯示:在最初的感染過程中,該病毒對(duì)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞有廣泛的嗜性,并隨著時(shí)間的推移和其自身的特點(diǎn)而逐漸向目標(biāo)器官轉(zhuǎn)移。

2.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是以先進(jìn)的芯片技術(shù)為基礎(chǔ)研發(fā)出來的一種檢測(cè)技術(shù),該技術(shù)具有高通量、檢測(cè)結(jié)果比較客觀等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在已成功地建立了NDV-IBV- AIV和IBDV的基因芯片。雙熒光定量PCR技術(shù),將非對(duì)稱PCR技術(shù)與基因微陣列技術(shù)相融合,并通過增大cy3標(biāo)簽引物的密度,使微陣列與目標(biāo)基因的雜交更加高效,更好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因的檢測(cè)。該技術(shù)可突破傳統(tǒng)生物分析手段只能對(duì)幾個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測(cè)定的局限,降低了分析結(jié)果的主觀性,并可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類型的混雜傳染病的同步診斷。

3 結(jié)束語

IBV的血清型別較多,變種層出不窮,不同種血清型之間的相互保護(hù)性較差,造成了機(jī)體的免疫應(yīng)答失效,給 IB的防控帶來了困難。近年來,國(guó)內(nèi)外對(duì) IBV的血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了大量的研究,但是各種檢測(cè)技術(shù)都有各自的優(yōu)勢(shì)和不足。在實(shí)際的養(yǎng)殖和臨床研究中,需要根據(jù)實(shí)際情況選用合適的檢測(cè)方法,情況比較復(fù)雜時(shí),需要聯(lián)合使用2種或多種檢測(cè)方法。隨著在分子水平上更加深入的研究,IBV檢測(cè)技術(shù)將不斷發(fā)展。