轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)研究進(jìn)展

魏杰鋒 徐順連 陳志

摘要：在介紹轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)概念基礎(chǔ)上，分析了轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)、蛋白組學(xué)枝術(shù)及代謝組學(xué)技術(shù)三方面綜合論述了轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)的檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果。大多數(shù)的研究結(jié)果已表明，轉(zhuǎn)基因作物并沒有產(chǎn)生明顯的大尺度的非預(yù)期效應(yīng)，但仍然不能完全排除轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)的可能，國內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性問題都未給出完全的肯定性結(jié)論。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因;抗蟲;作物;非預(yù)期效應(yīng);研究進(jìn)展

一、轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)

近些年來，隨著轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模栽培，轉(zhuǎn)基因作物的安全問題也引起了人們的普遍關(guān)注。關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的非預(yù)期效應(yīng)，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織、世界衛(wèi)生組織早就清楚地表明，基因組是外來基因的重新整合，除了適應(yīng)符合于人類需要的變化外，它還會(huì)產(chǎn)生意外效應(yīng)。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因作物在基因重組、轉(zhuǎn)錄及翻譯中所產(chǎn)生的RNA序列、蛋白質(zhì)序列、氨基酸序列等產(chǎn)生的錯(cuò)誤裝配情況，以及機(jī)體在新陳代謝過程中代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物生物學(xué)方式引起的序列混亂等不可避免地會(huì)產(chǎn)生意外效應(yīng)的突變。在這些性狀改變或者說性狀突變中，其中有一些人們可以通過對(duì)植物生物學(xué)代謝途徑等方面的認(rèn)知進(jìn)行預(yù)見，稱之為可預(yù)見性非預(yù)期效應(yīng)。轉(zhuǎn)入的基因在受體植物中繼續(xù)表達(dá)穩(wěn)定的相關(guān)蛋白，通過引進(jìn)和整合對(duì)人類有益的外來基因進(jìn)入受體的植物基因組，使受體植物表現(xiàn)出該特定外源基因在原物種中所表現(xiàn)出來的特定性狀。所以，把轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的非預(yù)期效應(yīng)定義為：通過基因工程所構(gòu)建的新物種所產(chǎn)生的除抗蟲害這一性狀以外的不同于原物種的效應(yīng)，這些效應(yīng)除了包括性狀改變，而且包括重組后的新物種基因組在性狀無差別情況下的新物種所存在的潛在差異性。

二、轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)產(chǎn)生機(jī)制

不管是可預(yù)見性非預(yù)期效應(yīng)，還是超出人類目前認(rèn)知水平的潛在性非預(yù)期效應(yīng)，主要通過以下幾種機(jī)制產(chǎn)生：

一是外源基因插入內(nèi)源基因的閱讀框，破壞了基因的核酸序列，使其不能有效地表達(dá)。

二是外源基因插入內(nèi)源基因調(diào)控的功能元件區(qū)，造成調(diào)控基因失去應(yīng)有的功能，從而使調(diào)控的內(nèi)源基因不能有效表達(dá)。

三是外源基因插入基因組的某個(gè)“敏感區(qū)”內(nèi)，使原本沉默的內(nèi)源基因“被激活”，而高效表達(dá)。

四是作為活性因子直接或間接誘導(dǎo)或抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的外源基因或表達(dá)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致這些內(nèi)源性基因表達(dá)的定性或定量變化。

所有這些原因的存在，或多或少會(huì)引起轉(zhuǎn)基因植物的變化，他們都存在可能引起轉(zhuǎn)基因植物代謝途徑的變化，進(jìn)而引起原植物本有性狀和特性的改變，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物非預(yù)期效應(yīng)的產(chǎn)生。

三、轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)的檢測(cè)方法

為了保證轉(zhuǎn)基因抗蟲作物生產(chǎn)的安全性，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)的檢測(cè)自然是必不可少的。近些年來，關(guān)于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的非預(yù)期效應(yīng)的研究得到了新進(jìn)展，其安全性檢測(cè)方法主要有兩類。一是方向性檢測(cè)，通過對(duì)一些主要營養(yǎng)元素和關(guān)鍵毒素進(jìn)行單組分分析，檢測(cè)其營養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子。二是非方向性檢測(cè)，它主要是結(jié)合功能性基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等方面對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的非預(yù)期效應(yīng)進(jìn)行安全性檢測(cè)，對(duì)一定的組成成分進(jìn)行分析比對(duì)，從而發(fā)現(xiàn)它們所存在的差異性或者變化。方向性檢測(cè)這種方法的不足是插入其中的一定外源基因所存在的非預(yù)期效應(yīng)大多具有不可預(yù)見性，且方向性檢測(cè)這種方式只是很簡單地分析了轉(zhuǎn)基因抗蟲作物中一部分化學(xué)成分及其變化，并不能夠相對(duì)準(zhǔn)確地使轉(zhuǎn)基因抗蟲作物中的外源基因?qū)е碌姆穷A(yù)期效應(yīng)正好表現(xiàn)出來。非定向性檢測(cè)方法對(duì)于定向性檢測(cè)方法是一個(gè)很好的補(bǔ)充，它可以檢測(cè)出可能存在的細(xì)胞和組織生理或者代謝水平方面的變化。對(duì)于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物來說，在食品安全評(píng)價(jià)中正逐步走向完善，對(duì)健康成長發(fā)育不利的各種非預(yù)期效應(yīng)都有望隨著這一系列“組學(xué)”技術(shù)的日益發(fā)展而得到相應(yīng)解決。

（一）轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)

轉(zhuǎn)錄組是指所有可以在活細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的RNA的總和，是研究和分析基因在整個(gè)RNA水平上的表達(dá)。DNA作為模板合成RNA的這樣一個(gè)轉(zhuǎn)錄途徑，實(shí)際上就是基因開始表達(dá)的第一步，同時(shí)，也是基因開始表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵一步，在轉(zhuǎn)錄組的概念中一定程度上包含了時(shí)間和空間的限制，相同的一個(gè)細(xì)胞在其不同的生長時(shí)期和生長環(huán)境下的相互影響和交叉影響下，它們的基因在表達(dá)上則完全不一樣。

在轉(zhuǎn)基因抗蟲作物中插入一定的外源靶基因，首先導(dǎo)致植物基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程的改變，進(jìn)一步在生理方面和代謝水平上導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因抗蟲作物生物代謝途徑發(fā)生改變，最后將會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)變異的出現(xiàn)。所以，人們可以通過對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲作物中所表現(xiàn)出來的差異表達(dá)的基因進(jìn)行比對(duì)分析，來追蹤和發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物代謝途徑可能發(fā)生的變化，并最終分析轉(zhuǎn)基因植物可能出現(xiàn)的非預(yù)期效應(yīng)，并對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。

近些年來，許多調(diào)查研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因抗蟲作物中，只有少量表達(dá)的基因發(fā)生了改變，并且這些遺傳變異不足以引起轉(zhuǎn)基因抗蟲作物顯著的非預(yù)期變異。例如，利用基因芯片技術(shù)對(duì)AEP抗真菌水稻的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)196個(gè)差異表達(dá)基因中約有一半是由轉(zhuǎn)基因引起的，剩下部分則是由環(huán)境影響造成的。又如，Gregersen等人，通過分析和比較轉(zhuǎn)基因小麥種子在發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小麥前額差異的基因數(shù)目非常少，這些變化還不足以對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的變異產(chǎn)生意外影響。又如，通過對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)ABF3基因的分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥的不同基因數(shù)量很少，并且沒有產(chǎn)生一些非常規(guī)效應(yīng)。另外，Coil等人使用微陣列技術(shù)，對(duì)相同環(huán)境中種植的Bt轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)分析的結(jié)果表明，其兩者轉(zhuǎn)錄序列僅僅有0.15%左右發(fā)生了差異性表達(dá)，其中，常規(guī)育種和轉(zhuǎn)基因?qū)D(zhuǎn)錄序列變異的貢獻(xiàn)率分別為37.4%和9.7%?？梢钥闯?，對(duì)于轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)錄組有很大影響的是自然變異，而通過基因轉(zhuǎn)化的影響比較微小，所以在GM作物安全性評(píng)價(jià)研究中，必須考慮到常規(guī)育種和環(huán)境條件對(duì)轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)錄組的影響。

需要說明的是，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物通過芯片檢測(cè)技術(shù)所能夠檢測(cè)出來的也僅僅限于少數(shù)差異性基因的表達(dá)，但是這些差異性基因的存在確實(shí)不足以使非預(yù)期效應(yīng)發(fā)生，因而，在一定程度上說明了大部分的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的安全性還是值得期待的?？墒氰b于這些轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的差異性基因方面的檢測(cè)，只是在植物體特定發(fā)育階段或者特定的環(huán)境條件下進(jìn)行，以此為依據(jù)來分析和評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物是否發(fā)生非預(yù)期效應(yīng)，毋庸置疑地忽視了很多因素，特別是不同發(fā)育時(shí)期和條件是否會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響作用。然而，在一定的生物發(fā)育時(shí)期和一定的環(huán)境條件下，芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲作物所表現(xiàn)出來的基因性改變的一系列情況，能不能在一定程度上表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因植物非預(yù)期效應(yīng)出現(xiàn)的可能，仍然值得探討。

（二）蛋白組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)主要是通過對(duì)蛋白質(zhì)的一個(gè)整體表達(dá)情況的分析比對(duì)，獲得在整體蛋白質(zhì)水平上的許多關(guān)于病理、藥理或者毒理等方面發(fā)生的可能性，以及整個(gè)細(xì)胞在代謝途徑中的全面完整而深層次的了解。

Coil等人對(duì)兩株轉(zhuǎn)基因玉米的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)它們的蛋白質(zhì)組相似性很高，這在一定程度上可以解釋控制基因之間存在著實(shí)質(zhì)的等價(jià)性。Mbo等也進(jìn)行了蛋白組學(xué)的相關(guān)研究，他們把轉(zhuǎn)Bt玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的蛋白組分別進(jìn)行了分析比對(duì)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt玉米與非轉(zhuǎn)基因參考系之間的差異并不可以明顯地分辨，與實(shí)質(zhì)上的等價(jià)性保持一致;同時(shí)，還對(duì)轉(zhuǎn)Bt玉米中的一百多個(gè)蛋白成分進(jìn)行了追蹤，通過分析他們的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，外源基因的插入對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲作物突變效果所造成的影響明顯地弱于一系列環(huán)境因子所發(fā)揮的作用。趙艷等分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻與常規(guī)水稻具有實(shí)質(zhì)等同性，而且不同環(huán)境變化的條件對(duì)水稻整個(gè)蛋白質(zhì)組發(fā)生變異的影響占比很明顯要高于單基因插入的影響。

Xue等分析和鑒定了轉(zhuǎn)基因水稻中攜帶Bt和磷酸烯醇丙醇轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牡鞍踪|(zhì)圖譜，從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在這兩種不同轉(zhuǎn)基因的水稻品系中的果糖-1一二磷酸醛縮酶都發(fā)生了或多或少地表達(dá)。

Barbosa等人分析和比較了轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆種子中酶和蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，結(jié)合2-DEMALDI-TOF-MS和電噴霧質(zhì)譜分析技術(shù)，從丙二醛（MDA）、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶和過氧化氫酶的含量與分離到的192種蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，上面所列出的四種物質(zhì)在含量上表現(xiàn)出明顯差異，轉(zhuǎn)基因大豆中的指標(biāo)這些都有所增高。

（三）代謝組學(xué)技術(shù)

代謝組學(xué)是新興的一門學(xué)科，主要是通過對(duì)生物機(jī)體所產(chǎn)生的代謝物進(jìn)行一系列的定量分析，借此來探尋有機(jī)體生理病理等相關(guān)變化，他是系統(tǒng)生物學(xué)不可或缺的一個(gè)重要組成部分。代謝組學(xué)是一門在某一時(shí)間點(diǎn)研究細(xì)胞內(nèi)所有代謝物的科學(xué)，基因序列與蛋白質(zhì)整體的表達(dá)相關(guān)聯(lián)，這樣代謝物就會(huì)較多地表現(xiàn)出細(xì)胞所存在的環(huán)境，它與細(xì)胞的營養(yǎng)情況、化學(xué)藥物和環(huán)境污染方面的影響以及其他外界因素的影響密切相關(guān)。

毛細(xì)血管電泳時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)是近些年來新發(fā)起的一種代謝組學(xué)分析技術(shù)，用于轉(zhuǎn)基因作物的代謝物輪廓譜，不僅在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的非預(yù)期效應(yīng)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，還能夠發(fā)現(xiàn)可能作為轉(zhuǎn)基因作物識(shí)別依據(jù)的新型生物標(biāo)志物。Kim等人在比較轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻時(shí)，在GC-MS技術(shù)的幫助下，成功地分離和比較了其中52種不同的化合物。

Picconi等人對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因玉米種子也做了相關(guān)方面的研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檸檬酸、乙醇、海藻糖和甜菜堿這四種物質(zhì)在轉(zhuǎn)Bt基因玉米種子里的含量都高于非轉(zhuǎn)基因玉米種子。Levan-di等人發(fā)現(xiàn)，利用CE-TOF-MS技術(shù)，從轉(zhuǎn)基因Bt玉米代謝產(chǎn)物中分離出的27種化合物中L-肉堿的含量有所增加。根據(jù)L-肉堿含量變化可以成為轉(zhuǎn)基因玉米樣品的生物標(biāo)志物。Rocio等人通過對(duì)大豆中40多個(gè)組分的綜合分析，認(rèn)為4-羥基蘇氨酸可作為轉(zhuǎn)基因大豆的生物標(biāo)志物。Leon等人結(jié)合加壓液相萃取、傅里葉變換粒子回旋共振質(zhì)譜（FTICR）和CE-TOF-MS研究了同一場(chǎng)體系的代謝產(chǎn)物剖面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，513種化合物在FTICR被清楚地分辨出來。與其親本相比，轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因玉米的酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、嘌呤、葉酸等10種代謝物水平增加，某些代謝途徑發(fā)生改變，尤其是與氨基酸相關(guān)的代謝途徑，并且鑒定了幾種新的生物標(biāo)志物。

四、展望

在過去的十幾年中，人們采用了多種方法培育了多種抗病蟲害的轉(zhuǎn)基因作物，并且取得了較大的進(jìn)展，到目前為止，大多數(shù)的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因作物并沒有產(chǎn)生明顯的大尺度的非預(yù)期效應(yīng)，盡管如此，轉(zhuǎn)基因作物通過基因重組所產(chǎn)生的在生長，繁殖和代謝過程中的潛在性危害不容忽視，依然未能夠完全排除轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)的可能，同時(shí)，國內(nèi)外對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的安全性問題都并未給出完全的肯定。

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)所生產(chǎn)出來的食品，在解決人類糧食和全世界饑荒問題上做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)，所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益也越來越大。傳統(tǒng)育種的歷史非常悠久，但它僅僅是局限在一定范圍內(nèi)，即有性雜交，而且還只能是近緣物種。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)是按照人們的意愿設(shè)計(jì)，把原有的基因組“成分”改造成新的基因組，它是一種新的育種方法，與傳統(tǒng)生物育種有著根本的區(qū)別。

轉(zhuǎn)基因抗蟲作物所發(fā)揮的作用大家有目共睹，確實(shí)從一定程度上解決了一系列糧食生產(chǎn)問題，但是對(duì)于新的變異種在新的環(huán)境中進(jìn)行新表達(dá)所產(chǎn)生的不確定性影響并不明朗，對(duì)于人類的繁衍進(jìn)化以及環(huán)境演繹進(jìn)化所知甚少，所以轉(zhuǎn)基因抗蟲作物非預(yù)期效應(yīng)的安全性問題將不容忽視。而且，國內(nèi)外都未能完全肯定轉(zhuǎn)基因食品的安全性，因此，對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的非預(yù)期效應(yīng)檢測(cè)非常必要。

基因組學(xué)技術(shù)、蛋白組學(xué)技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)的興起為很多學(xué)科及相關(guān)研究提供了契機(jī)，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的非預(yù)期效應(yīng)和非轉(zhuǎn)基因作物的基因表達(dá)也更多地能夠?yàn)槿藗兯煜?。組學(xué)技術(shù)為客觀評(píng)價(jià)和正確認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的非預(yù)期變異提供了有效新手段，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期變異效應(yīng)的突出優(yōu)勢(shì)是中性無偏倚的，但差異并不代表有害。比如，轉(zhuǎn)基因大豆中的丙二醛含量增加，可能對(duì)食用者產(chǎn)生經(jīng)口毒性，但表達(dá)量增高的抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶和過氧化氫酶卻可能有助于清除體內(nèi)的有害自由基。再如，轉(zhuǎn)Bt基因玉米中增加的L-肉堿，還可能促進(jìn)脂肪代謝而有利于減肥。此外，20多年來，Hermam等人在評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物的實(shí)質(zhì)等價(jià)性方面的研究和分析表明，植物組成的變化不僅發(fā)生在轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的意外效應(yīng)中，而且在所有傳統(tǒng)育種方法中都發(fā)生了變化;另一方面，轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)的機(jī)制也發(fā)生了變化。隨著轉(zhuǎn)基因作物廣泛地栽培種植，其越來越為人們所熟知，但是，這些突變的產(chǎn)生是不是由于轉(zhuǎn)基因過程導(dǎo)致的，還需要進(jìn)一步研究。