轉C0030.2.5基因玉米對大鼠的亞慢性毒性研究

王睿 張艷紅 胡貽椿 李敏 吳景歡 楊曉光 毛德倩

摘?要：目的：研究喂飼轉C0030.2.5基因玉米對大鼠的亞慢性毒性。方法：選用斷乳SD大鼠140只，隨機分為7組，即3個轉基因組（72.70%、36.35%、18.18%）、3個親本玉米組（72.7%、35.35%、18.18%）、1個常規(guī)基礎飼料對照組，每組20只，雌雄各半。動物2只/籠喂養(yǎng)，自由進食飲水，連續(xù)觀察90d。觀察大鼠體重、進食量、血液學指標、血生化指標，實驗結束后摘取動物臟器進行病理組織學檢查。結果：各劑量組動物的體重均呈增長趨勢，體重增長正常，中、末期的血液學和血生化指標中個別指標雖有統(tǒng)計學差異，但并無生物學意義。各主要臟器系數(shù)及病理組織學檢查比較，均未發(fā)現(xiàn)有生物學意義的改變。結論：現(xiàn)有實驗結果不能證實該轉C0030.2.5基因玉米對大鼠有亞慢性毒性作用。

關鍵詞：轉基因玉米;C0030.2.5基因;亞慢性毒性

轉基因玉米利用轉基因方法可以顯著提高玉米抗蟲、抗除草劑的品質，具有重要的經濟效益，但這種技術是否會對人體帶來危害，是社會關注的熱點問題[1-4]。本研究依據“實質等同性”原則[5]，按照中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準（NY/T 1102—2006）《轉基因植物及其產品食用安全檢測—大鼠90d喂養(yǎng)實驗》[6]，對轉C0030.2.5基因玉米進行了大鼠90d喂養(yǎng)實驗，了解分析該轉基因玉米是否會對大鼠產生亞慢性毒性作用，為該轉基因玉米的食用飼用性安全提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?樣品

轉C0030.2.5基因玉米（以下簡稱轉基因玉米）、轉化受體DBN567（以下簡稱親本玉米）、常規(guī)基礎飼料AIN-93G（以下簡稱對照玉米），均為黃色籽粒;C0030.2.5、DBN567，由北京大北農生物技術有限公司提供，經產品檢測后開展本次實驗。

1.2?材料與主要儀器

L535R湘儀低速冷凍離心機、BS-220型全自動生化分析儀、BC-5000VET全自動五分類血液分析儀、Leica HI1220烘片機、Leica RM2016輪轉式切片機、Leica HI1210攤片機、Leica EG1150H型石蠟包埋機。血細胞稀釋液及溶血劑，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;血生化檢測試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司、重慶中元生物技術有限公司。

1.3?實驗動物和飼養(yǎng)條件

選用北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的健康SD大鼠（SPF級，許可證號：SCXK（京）2012—0001）。飼養(yǎng)地點：匯智泰康生物技術（北京）有限公司，級別：屏障環(huán)境，許可證號：SYXK（京）2014—0022。

1.4?飼料配制

實驗開始前在北京市營養(yǎng)源研究所對各種玉米的營養(yǎng)成分進行全面檢測，參照美國營養(yǎng)研究所的AIN-93G配方，在保證營養(yǎng)平衡的基礎上計算轉基因玉米能摻入飼料的最大比例。經計算得出各玉米在飼料中的最大摻入量為72.70%，以此作為高劑量，中、低劑量的玉米摻入量分別設為35.35%、18.18%。以上飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司制備。配制好的飼料輻照滅菌后真空包裝保存供實驗使用。

1.5?實驗方法

選用斷乳SD大鼠140只，隨機分為7組，即C0030.2.5低、中、高劑量組（以下簡稱轉低、轉中、轉高），轉化受體玉米DBN567低、中、高劑量組（以下簡稱親低、親中、親高），AIN-93G（以下簡稱對照組）。每組20只，雌雄各半。動物2只/籠喂養(yǎng)，自由飲食，每周稱量1次大鼠體重，每周記錄1次給食量和剩食量，連續(xù)觀察90d。各組于實驗中期和末期分別采血測定各項血液學、血生化指標，實驗結束后摘取動物臟器進行病理組織學檢查。

1.6?觀察指標

1.6.1?動物的一般表現(xiàn)、體重、食物利用率?每周稱量1次大鼠體重，記錄1次給食量和剩食量。計算食物利用率：

食物利用率=實驗期內動物體重增加（g）/實驗期內動物總進食量（g）×100%（1）

1.6.2?血液學檢查?分別于實驗中期和末期對實驗動物血液中紅細胞（RBC）數(shù)、血紅蛋白（Hb）量、血小板（PLT）數(shù)、白細胞（WBC）數(shù)及其分類（中性、淋巴、單核）進行血液學指標測定。實驗中期大鼠眼內眥取血，實驗結束大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈采血。

1.6.3?臨床生化學檢查?實驗中期和末期動物空腹采血進行血液生化指標測定。測定指標為總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、尿素氮（UREA）、肌酐（CREA）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（ALP）。

1.6.4?臟體比?實驗結束處死動物取肝、腎、腎上腺、脾、胸腺、心臟、睪丸稱重，計算相應的臟體比（以百克體重計算）。

1.6.5?病理組織學?解剖進行大體觀察及組織病理學檢查。組織病理學檢查組分別為C0030.2.5高劑量組、對照玉米DBN567高劑量組、AIN-93G，檢查組織有腦、心臟、肺、肝、腎、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢和子宮。

1.7?統(tǒng)計方法

轉C0030.2.5基因玉米低、中、高劑量組與相應劑量的轉化受體DBN567組和AIN-93G對照組比較，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（ANOVA），方差齊時采用Bonferroni檢驗，方差不齊采用Games-Howell檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果與分析

2.1?生長狀況及食物利用率

對照組中有1只雌性動物在第9周意外死亡，大體解剖臟器未見異常，該組其他動物以及其余各組動物在整個實驗期間活動、生長正常，被毛濃密有光澤。雄、雌性大鼠C0030.2.5各劑量組與相應劑量的親本玉米DBN567組相比較，體重未見顯著差異（表1）。雄性大鼠轉中、轉低組總進食量低于相應劑量的親本組（P<0.05），雄性大鼠轉高組總食物利用率高于親高組（P<0.05），其余各劑量組雌、雄動物的總增重、總進食量以及總食物利用率未見顯著差異（P>0.05）（表2）。與對照組相比，雄性大鼠轉高、轉中、轉低組和親高、親中、親低組體重（表1）均有顯著性增加（P<0.05），尤其在實驗末期。雄性大鼠轉高組總食物利用率高于對照組（P<0.05）（表2），雄性大鼠3個親本組及轉高組體重增重和總進食量、轉低組體重增重、轉高組總食物利用率均高于對照組（P<0.05）。其余各雌、雄大鼠體重增重、總進食量、總食物利用率在各玉米摻飼劑量組和對照組之間未見顯著差異（P>0.05）（表2）。

2.2?血液學指標

實驗中期，雄性大鼠親高組、轉高組中性粒細胞顯著降低（P<0.05）;親高組、親低組、轉高組、轉中組淋巴細胞水平顯著增高（P<0.05）;轉高組、轉中組單核細胞百分比顯著降低（P<0.05）。在雌性大鼠中，親低組RBC水平顯著升高而WBC水平顯著降低（P<0.05），轉低組RBC與親本組比較顯著降低（P<0.05）（表3）。實驗末期，親高組1只雌性大鼠、轉高組2只雄性大鼠樣本出現(xiàn)凝血，對照組中1只雌性大鼠在第9周意外死亡，檢測結果未納入數(shù)據統(tǒng)計。與相應劑量的親本組比較，雄性大鼠轉高組WBC、轉中組中性粒細胞及淋巴細胞水平顯著降低（P<0.05）;與對照組相比，雄性大鼠親高組WBC水平顯著升高，親中組、親低組中性粒細胞顯著升高，親中組、轉低組淋巴細胞水平顯著降低，親低組、轉高組、轉低組PLT數(shù)顯著降低（P<0.05）;雌性大鼠轉中組血紅蛋白顯著升高，親低組、轉低組PLT數(shù)顯著升高（P<0.05）（表4）。由表3～4可見，實驗中期或末期有個別指標出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，或盡在實驗中期出現(xiàn)，或未呈現(xiàn)劑量—反應關系，且均在該品系動物正常值范圍內[7-8]，認為無生物學意義。其余各組各指標與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），轉基因其余各組各項指標與其相應劑量的親本對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3?血生化指標

實驗中期，與對照組相比，雄性大鼠3個親本組、轉高組、轉中組ALT水平顯著升高（P<0.05）;轉基因玉米各劑量組、親本各劑量組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組、轉中組GLU水平顯著升高、TC水平顯著降低（P<0.05）;親中組、轉中組、轉低組UREA水平顯著降低（P<0.05）;親高組、轉高組LDH水平顯著增高（P<0.05）。在雌性大鼠中，親高組、親中組、轉基因玉米各劑量組ALT水平顯著升高（P<0.05）;親高組、親低組、轉高組、轉低組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組、轉中組、轉低組UREA水平顯著降低（P<0.05）;親高組LDH水平顯著增高（P<0.05）（表5）。實驗末期，與相應劑量的親本組比較，雄性大鼠轉低組ALT、AST水平和轉中組TP、GLU水平顯著升高（P<0.05）。與對照組相比，雄性大鼠親高組、轉基因玉米各劑量組ALT水平顯著升高（P<0.05）;轉低組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組TP、ALB、GLU水平顯著降低（P<0.05）。在雌性大鼠中，親高組、親中組、轉低組AST水平顯著增高（P<0.05）（表6）。由表5～6可見，實驗中期與末期轉基因組和親本組有個別指標與對照組差異有統(tǒng)計學意義，但無劑量-反應關系且變化均在該品系動物正常值范圍內[8-10]，認為無生物學意義。其余各組各指標與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），轉基因其余各組各項指標與其相應劑量的親本對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.4?大鼠臟體比

實驗末期對各劑量組的臟器重量稱重，并計算臟體比。雄性大鼠親低組、轉低組肝臟臟體比顯著升高（P<0.05），親高、轉基因玉米各劑量組的腎臟臟體比顯著降低（P<0.05），親高組、親中組、轉低組腎上腺臟體比顯著降低（P<0.05），其余各組大鼠臟體比與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。轉基因各劑量組臟體比與相應親本組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表7）。

2.5?大體病理及組織學檢查

各組大鼠外觀、皮膚未見異常，胸、腹腔膜未見出血點、積液，主要臟器正常，未見明顯病理病變。對轉基因玉米、親本玉米以及AIN-93G對照組SD大鼠腦、心、肺、腎、肝、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢及子宮進行了病理組織學檢查，未見與受試物有關的特異性毒性病理改變。

3?討論

本研究將轉基因玉米及其親本對照分別摻入飼料給予大鼠90d，結果發(fā)現(xiàn)，雄性、雌性大鼠轉基因玉米各劑量組與相應劑量的親本對照玉米組相比較，體重、體重增長、周攝食量、對周食物利用度雖有個別統(tǒng)計學意義上的顯著性差異，但在歷史對照數(shù)據范圍內，且總體重增加、總進食量和總食物利用率未見顯著差異。實驗中期和末期各項血液學指標和血生化指標結果顯示，轉基因玉米各劑量組與相應劑量的親本對照玉米組相比較，有個別指標有統(tǒng)計學差異，但大部分有差異的指標沒有同時與2個對照組都存在差異或沒有同時在雌雄大鼠中存在差異，且基本上都在文獻報道的正常范圍之內[5-10]，且未出現(xiàn)劑量-效應關系。

臟器重量變化可轉基因玉米各劑量組與其相應劑量的親本對照相比較，臟器重量和臟體比均無顯著性差異（P>0.05）。實驗末期對7組SD大鼠腦、心、肺、腎、肝、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢及子宮進行了病理組織學檢查，未見與受試物有關的特異性毒性病理改變。此外，動物實驗中會受轉基因食品特性外的一些不確定因素的影響[11]，因此認為這些差異有可能與大鼠個體差異有關，而不應認為指標升高是因飼喂轉基因飼料造成的。

綜上所述，本實驗結果未發(fā)現(xiàn)具有對大鼠有生物學意義的亞慢性毒性作用。本研究還將開展急性毒性實驗、多代繁殖實驗、營養(yǎng)功效等研究，以更好地評價該轉基因玉米的食用安全性。

參考文獻

[1]郭紅衛(wèi).轉基因食品的安全性評價概況[J].上海預防醫(yī)學雜志，2001，13（4）：153-155.

[2]農業(yè)部.農業(yè)轉基因生物安全評價指南[S].2006：6.

[3]張力，程呈，何寧，等.轉基因高油酸大豆對大鼠的亞慢性毒性研究[J].毒理學雜志，2011，25（5）：391-394.

[4]張力，王靜，姜淑卿，等.轉Cry1Ab/Cry2Aj 和G10evo（EPSPS）基因抗蟲耐草甘膦玉米對大鼠的亞慢性毒性研究[J].環(huán)境與健康雜志，2016，33（7）：585-589.

[5]WHO.Application of the principles of substantial equivalence to the safety evaluation of food components from plants derived by modern biotechnolog[R].Geneva：WHO，1995：11.

[6]中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準，轉基因植物及其產品食用安全檢測——大鼠90d喂養(yǎng)實驗[S].北京：中華人民共和國農業(yè)部，2006.

[7]田輝，樊柏林.SPF級Wistar大鼠血液學及生化指標正常值范圍探討[J].實驗動物科學，2007，24（2）：23-24.

[8]蔣中仁，徐薇，金偉，等.SD大鼠血液學指標、血生化指標及臟體比正常值范圍探討[J].預防醫(yī)學情報雜志，2011，27（10）：789-791.

[9]齊云，蔡潤蘭，劉彬，等.新藥長毒試驗動物血液生化測定規(guī)范化研究系列之五[J].中國比較醫(yī)學雜志，2006，16（4）：193-196.

[10]朱華，高虹，黃瀾，等.清潔級SD大鼠標準生物學指標的建立[J].醫(yī)學動物防制，2005，21（9）：629-633.

（責任編輯?唐建敏）