HIV/AIDS患者外周血中4種細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-15和IL-21表達(dá)水平及其臨床意義研究

劉瓊?cè)A 劉志生 鄭煜煌 陳霞 賀波 鄭力文

〔摘要〕 目的 觀察外周血 4 種細(xì)胞因子（IL-2、IL-4、IL-15及IL-21）在HIV感染者/AIDS患者（HIV/AIDS）和正常人表達(dá)水平的區(qū)別及其與HIV RNA病毒載量和CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性，分析其與HIV感染的關(guān)系和臨床意義。方法 40例未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS 和31名正常人，采用ELISA法檢測(cè)外周血4種細(xì)胞因子（IL-2、IL-4、IL-15及IL-21），使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)外周血CD3+、CD4+ T 淋巴細(xì)胞數(shù)量，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定血清中HIV RNA水平。結(jié)果 未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS外周血IL-2、IL-15及IL-21水平低于正常人，而IL-4水平高于正常人（P<0.05）。CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量和各細(xì)胞因子水平顯示出一定的相關(guān)關(guān)系，IL-2和IL-15水平均與HIV-1 RNA載量呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 提示外周血4種細(xì)胞因子都可能參與了HIV感染的致病機(jī)制，并與HIV RNA病毒載量及CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 人免疫缺陷病毒;艾滋病;IL-2;IL-4;IL-15;IL-21

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R512.91 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕B ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.018

〔Abstract〕 Objective To observe the differences of 4 cytokine levels between HIV/AIDS patients and normal persons， and their relevance with HIV RNA level and CD3+， CD4+ cell count， and to analyze the relationship with HIV infection and clinical significance. Methods A total of 40 HIV/AIDS patients without antiviral therapy and 31 normal persons were enrolled. Enzyme Linked Immunosorbent Assay （ELISA） was used to detect 4 cytokine levels （IL-2， IL-4， IL-15 and IL-21）. At the same time， the number of CD3+ and CD4+ T lymphocytes in peripheral blood was detected by flow cytometry， and the level of HIV RNA in serum was determined by real-time polymerase chain reaction. Results IL-2， IL-15 and IL-21 in peripheral blood of HIV/AIDS patients without antiviral therapy were significantly lower than that of the normal people， and IL-4 level was higher than the normal people（P<0.05）. The number of CD3+， CD4+ cells and the level of each cytokine showed a certain correlation， and IL-2 and IL-15 levels were negatively correlated with HIV-1 RNA load. Conclusion It is suggested that all 4 cytokines in peripheral blood may be involved in the pathogenesis of HIV infection and are related to HIV RNA viral load and the number of CD3+ and CD4+ cells.

〔Keywords〕 human immunodeficiency virus; AIDS; IL-2; IL-4; IL-15; IL-21

人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）感染所致的艾滋病（AIDS）已成為危害人類(lèi)健康和生命的嚴(yán)峻問(wèn)題。至 2016年底全世界現(xiàn)存的HIV/AIDS達(dá)到3 670萬(wàn)人。截止2016年6月底中國(guó)大陸活著的HIV/AIDS有65.3萬(wàn)人，另有約20.1萬(wàn)人死亡[1]。加強(qiáng)對(duì)HIV傳播和AIDS發(fā)病的預(yù)防與控制已成為急待解決的燃眉之急。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART）能快速地抑制血液中的病毒，但無(wú)法根除細(xì)胞中的病毒儲(chǔ)存庫(kù)。近年來(lái)，科學(xué)家們已發(fā)現(xiàn)多種免疫細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子參與了HIV/AIDS的發(fā)病機(jī)制，并和血漿HIV病毒載量及外周血CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。研究這些細(xì)胞因子在HIV感染者中的變化及其在AIDS發(fā)病過(guò)程中的作用，有可能為加強(qiáng)抗HIV病毒效果提供新的輔助治療途徑[2]，為最終根除AIDS提供可能性。本研究對(duì)比觀察了外周血4種細(xì)胞因子在HIV/AIDS和正常人表達(dá)水平的區(qū)別，及其與血漿HIV RNA病毒載量和外周血CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 ?研究對(duì)象

40例HIV/AIDS患者均選自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院感染科門(mén)診，并經(jīng)過(guò)湘雅二醫(yī)院艾滋病研究室HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性和湖南省疾病預(yù)防控制中心HIV 抗體確認(rèn)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性確證為HIV-1感染。其中，男性 26人，女性14人，年齡（37.8±10.1）歲，均符合我國(guó)2001年制定的《HIV/AIDS診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)（試行）和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心2016年頒發(fā)的《國(guó)家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊(cè)》（第四版）的診斷標(biāo)準(zhǔn);并從未使用過(guò)抗 HIV 藥物、無(wú)明顯艾滋病表現(xiàn)、無(wú)腫瘤發(fā)生，女性無(wú)妊娠，心肝肺腎功能基本正常。31名對(duì)照正常人均來(lái)自湖南省婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)部。其中，男19人，女性12人，年齡（34.5±13.6）歲，身體健康，均檢測(cè)HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)陰性，其余同HIV/AIDS組。本研究啟動(dòng)前經(jīng)湘雅二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并向研究對(duì)象說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的意義、可能的副作用及其他注意事項(xiàng)，均簽署知情同意書(shū)。

1.2 ?外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)和血漿HIV RNA定量檢測(cè)

40例HIV-AIDS患者以EDTA真空采血管采集靜脈血2 mL，每支試管各取100 μL全血分別加入CD3-PreCP、CD4-PE、CD8-PE熒光單克隆抗體（美國(guó)BD 公司），混合后置室溫避光孵育，加入溶血素再避光孵育，離心棄上清PBS洗滌2次，送FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)，以Cell Guest 軟件收集分析處理好的標(biāo)本，分析 CD3+總T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD3+、CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)和CD3+、CD4+ 淋巴細(xì)胞數(shù)。離心分離的血漿置-80 ℃保存待測(cè)，HIV 核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)（FQPCR HIV RNA）試劑盒（深圳市PG生物工程公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字SZ20020041），Gene Amp 7300序列檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)PE公司）。操作程序嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，定量線性范圍 50 拷貝/mL～1 000 000拷貝/mL。

1.3 ?外周血細(xì)胞因子的血清濃度檢測(cè)

使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定40例HIV/AIDS和31名正常對(duì)照者血清中細(xì)胞因子的濃度。IL-2和IL-21試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技公司，IL-4試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程公司，IL-15 試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

1.4 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件和Excel軟件進(jìn)行分析。資料以“x±s”表示。計(jì)量資料符合條件（正態(tài)分布/方差齊性）者采用t檢驗(yàn)，不符合條件者，采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析各變量的相關(guān)性，計(jì)算其相關(guān)系數(shù)及其P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?外周血CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量和血漿HIVRNA 定量檢測(cè)

40例未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者外周血CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量平均值為（194.98±95.25）個(gè)/μL，其中20例行血漿HIV RNA定量檢測(cè)，其log值的水平為（4.35±1.15）。做相關(guān)性回歸分析，二者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.56，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

2.2 ?HIV/AIDS血漿4種細(xì)胞因子水平與正常人的區(qū)別

40例HIV/AIDS的血漿IL-2、IL-15及IL-21水平低于正常人（t=2.690、2.550、2.780，P=0.001、0.022、0.000）;IL-4水平高于正常人（t=2.870，P=0.000）。見(jiàn)表1。

2.3 ?HIV/AIDS血漿4種細(xì)胞因子水平與CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)的關(guān)系

對(duì)40例HIV-AIDS患者血漿IL-2、IL-4、IL-15及IL-21的水平與外周血CD3+、CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：IL-4水平與CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.48，P<0.01）;IL-2、IL-15與CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量則呈正相關(guān)（r=0.36，P=0.002;r=0.52，P<0.001，r=0.68，P=0.017）。

2.4 ?HIV-AIDS血漿4種細(xì)胞因子水平與HIV RNA病毒載量的關(guān)系

20例HIV-AIDS做了血漿HIV RNA水平檢測(cè)， 其log值的水平為（4.35±1.15）。血漿IL-2、IL-4、IL-15及IL-21的水平與血漿HIV-1 RNA載量相關(guān)性分析顯示，IL-4和IL-21水平與血漿HIV- 1 RNA載量的相關(guān)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.213和-0.190，P=0.076和0.173）;而IL-2及IL-15水平均與HIV-1 RNA載量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.33和-0.34，P=0.040和0.031）。

3 討論

研究表明，多種免疫細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子在HIV感染機(jī)體后發(fā)生了顯著改變，而在接受 HAART治療的進(jìn)程中這些變化得以不同程度矯正，反映這些細(xì)胞和細(xì)胞因子可能參與抗HIV的免疫應(yīng)答過(guò)程，AIDS發(fā)病機(jī)制也與其有一定關(guān)系。挖掘這些細(xì)胞因子和HIV發(fā)病的內(nèi)在聯(lián)系，揭露其對(duì)抗病毒治療的影響，極大可能為強(qiáng)化抗HIV病毒效果開(kāi)辟嶄新的治療方向[1-2]。細(xì)胞因子廣泛作用于啟動(dòng)、維持與調(diào)節(jié)免疫自身穩(wěn)定和炎癥性過(guò)程中[3]，許多細(xì)胞因子因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)上有共同的γ受體鏈，如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21等，具有不少近似的功能，同時(shí)它們也有各自的特點(diǎn)[4-5]。目前已有臨床試驗(yàn)表明，γ 鏈細(xì)胞因子中的IL-2、IL-7及IL-21在增強(qiáng)抗病毒作用和促進(jìn)免疫重建方面有積極效果[6-8]。然而，目前針對(duì)γ鏈細(xì)胞因子與HIV感染關(guān)聯(lián)性的報(bào)告尚不多見(jiàn)。

IL-2是分子級(jí)別第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)，且最早被用于AIDS患者輔助治療的常見(jiàn)γ 鏈細(xì)胞因子，在抗各種感染包括HIV感染的免疫反應(yīng)中都起到了重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]IL-2和抗HIV免疫應(yīng)答存在某些必然關(guān)聯(lián)。但是，由于IL-2對(duì)先天免疫和獲得免疫反應(yīng)均有刺激效應(yīng)，高劑量使用時(shí)可引發(fā)突出的毒性反應(yīng)[11-12]。某些患者單一使用HAART無(wú)法獲得明顯免疫反應(yīng)，聯(lián)用IL-2后出現(xiàn)輔助的臨床作用[13]，但也存在部分臨床觀察未發(fā)現(xiàn)IL-2對(duì)HAART的強(qiáng)化效果[14-15]。

IL-21是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，主要由CD3+、CD4+細(xì)胞產(chǎn)生，在T細(xì)胞抗病毒感染應(yīng)答過(guò)程中起重大的作用，對(duì)慢性病毒感染控制發(fā)揮免疫增強(qiáng)效應(yīng)。數(shù)據(jù)表明，未經(jīng)臨床干預(yù)的HIV/AIDS血漿IL-21水平低于正常人，并且與CD3+、CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，IL-21通過(guò)對(duì)CD4+、CD8+細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的調(diào)節(jié)，發(fā)揮控制病毒感染的功能[16];急慢性HIV感染者在未經(jīng)干預(yù)前均可被檢測(cè)到因HIV特異而釋放IL-21的CD4+細(xì)胞，而這些細(xì)胞頻率的高低影響相關(guān)的病毒控制程度，且可以干預(yù)CD8+細(xì)胞的維持來(lái)促進(jìn)對(duì)病毒的控制[17-18]。因此，在促進(jìn)HIV感染者的NK細(xì)胞反應(yīng)和控制病毒復(fù)制層面，IL-21可能有積極的輔助治療意義[19]。

IL-4大多由CD4+Th2細(xì)胞釋放，常見(jiàn)生物學(xué)作用是：刺激T細(xì)胞的增殖、分化，抑制Th1細(xì)胞的增殖與應(yīng)答，通過(guò)自分泌途徑激發(fā)Th2細(xì)胞亞群的擴(kuò)增，以及抑制巨噬細(xì)胞的功能。本研究發(fā)現(xiàn)HIV/AIDS患者的IL-4水平高于正常人，反映其與HIV感染機(jī)制存在可能關(guān)系。

IL-15由多種細(xì)胞產(chǎn)生，生物學(xué)效能與 IL-2相仿。在此次研究中觀察到HIV/AIDS患者的IL-15 水平明顯低于正常人，提示HIV感染的免疫受損過(guò)程中可能有其參與。目前研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)IL-15含量下降的HIV/AIDS補(bǔ)充外源性IL-15可以明顯增強(qiáng)其免疫細(xì)胞的功能。國(guó)外報(bào)告表明，IL-15及其受體可作為DNA疫苗中產(chǎn)生和保持記憶CD8+細(xì)胞的有效方式，進(jìn)而對(duì)CD8+細(xì)胞親和性成熟機(jī)制加以解釋?zhuān)型麕椭滦鸵呙绲难兄芠20-21]。

綜上所述，現(xiàn)有研究充分說(shuō)明C細(xì)胞因子的重要意義：促進(jìn)外周血T細(xì)胞的自身穩(wěn)定、存活增殖和功能調(diào)節(jié)，參與各種抗感染免疫的反應(yīng)過(guò)程，其中某些因子已用于臨床疾病的輔助免疫治療和疫苗佐劑研發(fā)。由于存在種族遺傳差異，不同國(guó)家人群的細(xì)胞免疫特征也不盡相同，HIV-1流行病毒株在各個(gè)地區(qū)也有一定區(qū)別，因此在中國(guó)范圍內(nèi)研究血細(xì)胞因子在HIV/AIDS感染的發(fā)病機(jī)制和抗病毒免疫應(yīng)答中所扮演的角色具有巨大的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。本研究對(duì)未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者外周血常見(jiàn)的4個(gè)細(xì)胞因子濃度進(jìn)行了初步觀察，分析發(fā)現(xiàn)它們與主要的免疫重建指標(biāo)CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量及主要的病毒學(xué)指標(biāo)血漿HIV RNA水平存在不同程度的相關(guān)性。隨著進(jìn)一步的深入研究和臨床觀察有可能更清楚地了解HIV/AIDS的免疫發(fā)病機(jī)制，為艾滋病抗病毒治療的輔助手段拓展新思路，為探索新更精準(zhǔn)的免疫干預(yù)途徑打下基礎(chǔ)。

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