紅景天苷對UVB輻射HaCat細胞活性及Caspase-3/9蛋白表達的影響

劉朝圣 申夢潔 韓曉鳳 彭麗麗 刁慶春

〔摘要〕 目的 研究紅景天苷對中波紫外線（ultraviolet B， UVB）輻射HaCat細胞增殖及Caspase-3、Caspase-9蛋白表達的作用。方法 將HaCat細胞分為6組：即正常對照組（Ⅰ組）、紅景天苷中劑量組（Ⅱ組）、UVB輻射組（Ⅲ組）、UVB+紅景天苷低劑量組（Ⅳ組）、UVB+紅景天苷中劑量組（Ⅴ組）、UVB+紅景天苷高劑量組（Ⅵ組），Ⅰ組未經(jīng)任何處理，Ⅱ組加入40 μg/mL的紅景天苷，Ⅲ組接受200 mJ/cm2劑量紫外線照射，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別加入10、40、80 μg/mL紅景天苷并進行200 mJ/cm2紫外線照射。HaCat細胞培養(yǎng)24 h后，采用MTT法檢測細胞活力，流式細胞儀觀察細胞周期，Western blotting法檢測Caspase-3、Caspase-9表達的蛋白水平。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示隨著紅景天苷濃度的增加，HaCat細胞的生存率逐漸增加;流式細胞儀檢測細胞周期顯示HaCat細胞的S峰值隨著紅景天苷濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢，Ⅵ組S峰值高于Ⅱ組;Western blotting顯示Ⅵ組Caspase-3/9的蛋白表達量均有下降。結(jié)論 紅景天苷可通過抑制Caspase-3和Caspase-9蛋白表達，減少UVB誘導HaCat細胞凋亡。

〔關鍵詞〕 紅景天苷;中波紫外線;細胞增殖;Caspase-3;Caspase-9

〔中圖分類號〕R285.5;R818 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.005

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Salidroside on proliferation and expression of Caspase-3/9 protein in HaCat cells induced by ultraviolet B （UVB） radiation. Methods HaCat cells were divided into 6 groups： a normal control group （group I）， a medium dose of Salidroside group （group II）， a UVB radiation group （group III）， a UVB+ low dose of Salidroside group （group IV）， a UVB+ medium dose group （group V）， a UVB+ high dose of Salidroside group （VI group）. Group I was not treated. Group II was added with 40 μg/mL of Salidroside; Group III was irradiated with ultraviolet radiation at 200 mJ/cm2; Group IV， Group V， Group VI were added with 10 μg/mL， 40 μg/mL， 80 μg/mL of Salidroside respectively and irradiated with 200 mJ/cm 2 doses of ultraviolet. After 24 hours of HaCat culture， cell viability was detected by MTT assay， and cell cycle was observed by flow cytometry. The protein levels of Caspase-3 and Caspase-9 were detected by western blotting. Results The results of MTT showed that the survival rate of HaCat cells was increased with the increase of Salidroside concentration. Flow cytometry suggested the S peak of HaCat cells increased with the increasing concentration of Salidroside. The S peak of group VI was higher than that of Group II. Western blotting revealed that the protein expression of Caspase-3/9 decreased in the Salidroside group with high concentration. Conclusion Salidroside can reduce HaCat cell apoptosis induced by UVB through inhibiting the expression of Caspase-3 and Caspase-9 protein.

〔Keywords〕 Salidroside; ultraviolet B; cell proliferation; Caspase-3; Caspase-9

多數(shù)天然產(chǎn)物含有抑制細胞凋亡作用的成分，紅景天作為一種常用的高原中藥材，其主要有效成分包括紅景天苷、酪醇及紅景天多糖等，其中紅景天苷是從大株紅景天的干燥根及根莖或干燥全草中提取的主要有效成分，現(xiàn)代藥理學研究證實，紅景天在皮膚科的應用中具有抗衰老[1]、防光老化[2]、抗菌[3]、抗輻射等多種活性作用，且副作用較小[4]。本文研究了不同濃度紅景天苷對中波紫外線（ultraviolet B， UVB）輻射HaCat細胞的增殖活性及對內(nèi)源性凋亡途徑中的凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白水平的影響，探討其抗輻射機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），二甲基亞砜（Sigma公司），MTT溶液（Amresco公司），嗅化乙錠（PI）染液、RNA酶、胎牛血清（均來自永捷實驗室），青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、RIPA裂解液、BCA試劑盒（均來自碧云天生物技術研究所），兔抗人Caspase-3一抗、兔抗人Caspase-9一抗、鼠抗人β-actin一抗（均來自Abcam公司），HRP（辣根過氧化物酶）標記的羊抗鼠IgG二抗、HRP標記的羊抗兔IgG二抗（均來自Sant Cruz公司），ECL發(fā)光試劑盒（美國Thermo Scientific公司）。人類永生化角質(zhì)形成細胞株（HaCat細胞）由重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科實驗室保存并提供;紅景天苷（每支20 mg，批號：H-040-141103）購自中國四川成都瑞芬思生物科技有限公司，實驗中用滅菌蒸餾水按所需濃度溶解配制。

1.1.2 ?主要儀器 ?311窄譜UVB治療儀（深圳半島醫(yī)有限公司），DNM-9602G酶標儀分析儀（北京普朗公司），流式細胞儀（美國 Bio-Rad 公司），Model Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)（美國 Bio-Rad 公司），電泳儀、電轉(zhuǎn)槽、搖床（上海一恒）等。

1.2 ?實驗方法

1.2.1 ?細胞培養(yǎng) ?HaCat細胞采用細胞生長液（高糖DMEM、10%FBS、青霉素100 U/mL以及鏈霉素100 ？滋g/mL），于5% CO2、37 ℃細胞孵育箱中孵育。培養(yǎng)過程中，維持細胞密度在70%～90%的狀態(tài)，依細胞生長狀態(tài)3～4 d傳代1次。經(jīng)過2次傳代后，擇其生長旺盛、狀態(tài)良好的細胞進行分組實驗。

1.2.2 ?細胞分組及處理 ?調(diào)整HaCat細胞懸液濃度為（8～10）×104/mL，每孔1 mL接種在6孔板中，90%融合后進行藥物干預處理及紫外線照射。分成6個組進行實驗。正常對照組（下稱Ⅰ組）：普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，不進行紫外線照射;紅景天苷中劑量組（40 μg/mL，下稱Ⅱ組）無紫外線照射;UVB輻射組（下稱Ⅲ組）：無任何試劑，紫外線照射;UVB+紅景天苷低劑量組（10 μg/mL，下稱Ⅳ組）進行紫外線照射;UVB+紅景天苷中劑量組（40 μg/mL，下稱Ⅴ組）進行紫外線照射;UVB+紅景天苷高劑量組（80 μg/mL，下稱Ⅵ組）進行紫外線照射。

紫外線照射方法：將培養(yǎng)細胞置于距離紫外光光源垂直距離為2 cm的地方（每孔加入2 mL PBS），照射功率為200 mJ/cm2，照射時間為30 s。UVB照射后再常規(guī)培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)細胞進行相關指標檢測。

1.3 ?檢測指標及方法

1.3.1 ?四唑鹽（MTT）比色法檢測各組細胞生存率 ?將細胞以1×104/mL接種到96孔板中，每孔100 μL，待細胞貼壁后，去除原培養(yǎng)液，進行實驗分組并增設空白組，每組3個復孔。96孔板中細胞經(jīng)UVB輻射后24 h，各孔中加入5 mg/mL MTT 10 μL至MTT的終濃度為0.5 mg/mL，孵育箱中培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）進行溶解，室溫下?lián)u床震蕩5 min，使甲瓚結(jié)晶完全溶解，用自動酶標儀測定490 nm處吸光度A值，計算存活率。每組取各復孔的平均值，以空白組吸光度值調(diào)零。實驗重復3次。

存活率=（A值處理組-A值陰性對照組）/（A值陽性對照組-A值陰性對照組）×l00%

1.3.2 ?流式細胞儀（FCM）檢測細胞周期 ?收集各組實驗細胞，PBS清洗2次。用提前預冷的75%乙醇4 ℃過夜固定細胞，離心（3 000 r/min，5 min），棄上清，PBS清洗2次，并離心（3 000 r/min，5 min）棄上清，每個樣本加入80 μL的50 μg/mL RNA酶，37 ℃孵育30 min后，加入100 μL的50 μg/mL的嗅化乙錠（PI）染液，混勻，室溫避光孵育10 min后，液體經(jīng)100 μm濾網(wǎng)膜過濾后上機檢測細胞周期，經(jīng)儀器自帶軟件處理直接得出細胞增殖活性。

1.3.3 ?Western Blotting方法測定Casepase-3/9蛋白表達 ?使用PIPA細胞裂后按產(chǎn)品試劑盒說明用 BCA法檢測蛋白濃度，取等量的蛋白樣品（40 μg）經(jīng)10% SDS-PAGE分離膠和80 V恒壓電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉加PBST配置成封閉液室溫封閉2 h，加入鼠抗人β-actin 一抗按1∶5 000 BSA稀釋，兔抗人 Caspase3/9 一抗按1∶1 000 BSA稀釋，4 ℃搖床搖動孵育封閉過夜;TBST（H2O+TBS+Tuween20）洗滌3次（每次10 min）后，加入1∶2 000稀釋的HRP標記羊抗鼠或羊抗兔二抗，在室溫下孵育1 h，TBST再次洗膜3次（每次10 min），小心吸凈洗膜液后加入ECL發(fā)光底物，關閉電源，在凝膠成像系統(tǒng)中成像、攝圖。重復3次。應用Quantity One軟件對紅景天苷蛋白的相對表達量進行分析，測定圖片上每個特異條帶的灰度值，用目的蛋白的灰度值/內(nèi)參β-Actin的灰度值，所得結(jié)果為目的蛋白相對含量。

1.4 ?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以“x±s”表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）;以P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ?MTT法檢測細胞的生存率

如表1所示：與Ⅰ組比較，UVB照射對HaCat細胞的存活率有統(tǒng)計學意義（P<0.05），相同劑量的UVB照射條件下隨著紅景天苷的濃度增加HaCat細胞的OD值呈逐漸上升趨勢，10、40、80 μg/mL紅景天苷組的生存率分別為（75.37±13.45）%、（80.87±11.12）%、（84.65±9.22）%，與Ⅱ組、Ⅲ組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 ?流式細胞儀檢測細胞周期比較增殖活性

利用PI染色法結(jié)合流式細胞儀觀察對HaCat細胞周期的影響， 根據(jù)ModFit軟件分析得到實驗數(shù)據(jù)，如圖1、表2所示：在G0/G1期，與Ⅰ組比較，Ⅲ組的細胞含量（56.68±0.011）%為最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與Ⅱ組比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且隨著紅景天苷的濃度增加，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組的細胞分裂數(shù)量逐漸下降;與Ⅲ組相比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且在相同條件下UVB照射后，隨著紅景天苷的濃度增加，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組細胞的活躍度呈上升趨勢。在S期，Ⅰ組細胞活性明顯高于Ⅲ組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與Ⅲ組比較，在相同條件下UVB照射后，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組細胞活性明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且隨著紅景天苷的濃度增加細胞的活躍度呈上升趨勢，Ⅵ組HaCat細胞活性值最高。在G2/M期，與Ⅲ組比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組的凋亡細胞數(shù)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 ?Western Blotting方法測定Casepase-3、Casepase-9蛋白表達

從Caspase-3、Casepase-9的蛋白表達來看，與Ⅰ組比較，Ⅲ組的表達量均明顯高于Ⅰ組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與Ⅱ組比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;各實驗組Caspase-3、Casepase-9隨著紅景天苷濃度的增加，蛋白表達量逐漸下降，尤以高濃度紅景天苷組（Ⅵ組）下降最為明顯，與Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果表明低濃度（10 μg/mL）的紅景天苷對HaCat細胞的防護作用最差，而高濃度的紅景天苷組對HaCat細胞有一定的抑制凋亡的作用。見圖2、表3。

3 討論

日常生活中的UVB照射可誘使皮膚出現(xiàn)光老化、免疫抑制改變及發(fā)生皮膚癌變等。這些變化與UVB照射后細胞內(nèi)產(chǎn)生數(shù)量較多的氧自由基（reactive oxygen specie，ROS）有關，它可以引起皮膚表皮及真皮細胞內(nèi)的DNA損傷，從而導致皮膚癌的發(fā)生，因此如何防護其損傷顯得尤為重要。從天然植物和傳統(tǒng)藥物中開發(fā)新型抗輻射藥具有高效和低毒副作用等優(yōu)點。

紅景天是景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，《四部醫(yī)典》中記載它具有扶正固本，理氣養(yǎng)血，滋補強身之功效，藏族人民稱之為“雪域仙草”。紅景天多生長在海拔4 000多米的雪域高原上，其高原地屬紫外線輻射強烈地帶，故在雪域高原上生長的植物大部分都具有抗紫外線的特性。近幾十年來，國內(nèi)已經(jīng)研發(fā)含有紅景天成份的各類護膚產(chǎn)品，但其美白、抗氧化、防輻射等作用機制研究仍不夠明確，因此值得大家深入研究。

Caspase家族屬于介導細胞凋亡的一大類調(diào)節(jié)基因，是細胞凋亡的啟動和執(zhí)行者，是凋亡信號傳導的共同通路。其中Caspase-9位于Caspase級聯(lián)反應的最上游，能在其它細胞因子的參與下發(fā)生自我活化并激活下游執(zhí)行型Caspase，如Caspase-3，后者可特異性地裂解底物使細胞發(fā)生生化及形態(tài)學改變，最終導致細胞凋亡[5-7]。有相關藥理學研究表明紅景天苷可通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-xl通路[8]、紋狀體中DA、DOPAC和HVA的水平[9]，或者抑制慢性缺氧誘導的PASMCs增殖[10]、增加Bax/Bcl-2比例[11]，或者抑制Caspase-3、Caspase-8、caspase-9活化等多種不同路徑，從而誘導細胞進行凋亡[12]。有研究證明紅景天苷可發(fā)揮抗多系統(tǒng)細胞氧化及細胞衰老的作用[13]，抗炎抗腫瘤，保護血管等[14-17]。本實驗在臨床觀察基礎上，從細胞凋亡角度探討紅景天抗輻射作理機制。

本實驗結(jié)果表明，不同濃度的紅景天苷的均能提高HaCat細胞存活率，增加細胞分裂活性，且呈濃度依賴性趨勢。在相對蛋白表達中，細胞因子Caspase-3、Caspase-9中UVB組（Ⅲ組）蛋白含量明顯高于其他各實驗組，而不同濃度的紅景天苷組 Caspase-3、Caspase-9相對蛋白表達均下調(diào)，尤以高濃度的下降最明顯，結(jié)果與張偉等[18]、史飛等[19]、饒燕等[20]相關研究報道基本一致。這表明紅景天抗紫外線輻射的作用機制可能是通過下調(diào)凋亡級聯(lián)因子從而減少細胞的凋亡水平而實現(xiàn)，本研究為紅景天在臨床應用和產(chǎn)品研發(fā)提供了一定實驗依據(jù)。

參考文獻

[1] 葉 ?剛，楊 ?銳，楊懷銘.云南紅景天對衰老模型大鼠的抗衰老作用[J].中國老年學，2014，34（14）：3960-3962.

[2] 袁小英，馬慧敏，邵麗芳.紅景天苷對紫外線照射損傷HaCat細胞Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響[J].空軍醫(yī)學雜志，2014，30（2）：90-92.

[3] 馬慧敏，趙 ?琦，劉 ?瑋.UVB對成纖維細胞中IFI16表達的影響[J].中國麻風皮膚病雜志，2018，34（1）：25-28.

[4] 楊 ?卓，龍 ?旭，蘭澤倫.圣地紅景天研究進展[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學，2011，37（4）：243-244.

[5] CHO B B， TOLEDO-PEREYRA L H. Caspase-independent programmed cell death following ischemic stroke[J]. Journal of Investigative Surgery，2008，21（3）：141-147.

[6] JENS M W， HANS J S. A microscopic technique to study kinetics and concentration response of drug-induced Caspase-3 activation on a single cell level[J]. Journal of Phamacological and Toxicological Methods，2008，57（2）：131-137.

[7] 周 ?舟，王小華，朱光旭，等.Caspase-3、-9表達上調(diào)參與缺氧誘導心肌細胞凋亡[J].第三軍醫(yī)大學學報，2005，27（3）：185-188.

[8] LAI W， ZHENG Z， ZHANG X， et al. Salidroside-mediated neuroprotection is associated with induction of early growth response genes （Egrs） across a wide therapeutic window[J]. Neurotoxicity Research， 2015，28（2）：1-14.

[9] ZHANG W， HE H， SONG H， et al. Neuroprotective effects of salidroside in the MPTP mouse model of Parkinson's disease： involvement of the PI3K/Akt/GSK3β pathway[J]. Parkinson's Disease，2016，2016（2）：1-9.

[10] CHEN M， CAI H， YU C， et al. Salidroside exerts protective effects against chronic hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension via AMPKα1-dependent pathways[J]. American Journal of Translational Research，2016，8（1）：12-27.

[11] YAN Z Q， CHEN J， XING G X， et al. Salidroside prevents cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion in rats[J]. Journal of International Medical Research，2015，43（3）：402-411.

[12] 趙 ?敏，邊 ?芳，田卓華，等.甘草、紅景天及黃芪粗提取物對UVB誘導小鼠皮膚慢性光損傷的保護作用[J].世界科技研究與發(fā)展，2015，37（3）：295-299.

[13] 李 ?慧，孫樂棟.紅景天苷抗衰老和抗氧化藥理機制研究新進展[J].中國醫(yī)藥導報，2018，15（7）：51-54，81.

[14] 蒲位凌，李文華，白茹玉，等.紅景天及其抗炎和抗腫瘤活性成分藥理作用研究進展[J].天津中醫(yī)藥，2017，34（12）：856-859.

[15] 龔 ?舒，甘 ?淋.紅景天苷藥理作用的分子機制研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31（5）：696-699.

[16] 姜愛玲，張 ?巖.JIANGAi-ling，等.紅景天苷藥理作用的研究進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2015，20（10）：1161-1164.

[17] 張明發(fā)，沈雅琴.紅景天苷的血管藥理作用研究進展[J].藥物評價研究，2017，40（5）：717-724.

[18] 張 ?偉，趙俊杰，李 ?濤，等.紅景天苷對神經(jīng)退行性疾病作用的研究進展[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2016，36（7）：86-90.

[19] 史 ?飛，李 ?鈾，李建標，等.紅景天甙對UVA/UVB輻射的成纖維細胞中caspase-3和caspase-8活性的影響[J].中國麻風皮膚病雜志，2011，27（12）：832-834.

[20] 饒 ?燕，韓曉鳳，陶春蓉.紅景天苷對中波紫外線誘導HaCat細胞凋亡的影響[J].解剖學雜志，2018，41（1）：9-12.