心康沖劑改善慢性心衰模型大鼠心肌凋亡及調(diào)控Caspase-3/9的表達(dá)

劉蓉芳 毛以林 譚雄 張輝 毛湘屏 楊柳 陳志成

〔摘要〕 目的 探討心康沖劑對(duì)心衰大鼠Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的調(diào)控作用。方法 58只SD大鼠分為正常組10只，模型組、心康組及對(duì)照組各16只，造模完后，心康組給予心康沖劑溶液0.5 g/kg灌服，對(duì)照組予芪藶強(qiáng)心膠囊溶液0.06 g/kg灌服。采用心臟彩超檢測(cè)心功能;心臟切片行TUNNEL染色法觀察心肌細(xì)胞凋亡;心肌組織采用Real-time PCR法及免疫組化法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9基因及蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果 與正常組比，模型組大鼠Caspase-3及Caspase-9的mRNA與蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01），TUNNEL染色觀察細(xì)胞凋亡明顯增多;與模型組比較，心康組大鼠心肌凋亡減輕， Caspase-9 mRNA、Caspase-3 mRNA及蛋白明顯下降（P<0.01）;與對(duì)照組相比，心康組心肌細(xì)胞凋亡相對(duì)降低，Caspase-3蛋白表達(dá)下降（P<0.05）。結(jié)論 心康沖劑可調(diào)控下調(diào)Caspase-3、Caspase-9表達(dá)抗心衰。

〔關(guān)鍵詞〕 心肌凋亡;Caspase-3;Caspase-9;慢性心衰;心康沖劑

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R541.6 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the regulatory effects of Xinkang Granule （XKG） on the rats with chronic heart failure （CHF） for the expression of Caspase-3 and Caspase-9. Methods A total of 58 SD rats were randomly divided into a normal group （n=10）， a model group， a XKG group， and a control group， with 16 rats in each group. After the success of the modeling， the XKG group was given XKG solution at 0.5 g/kg， and the control group was given Qili Qiangxin Capsule （QLQXC） solution at 0.06 g/kg. Cardiac function was measured by echocardiography; Heart slices were stained by TUNNEL to observe myocardial apoptosis. The expression of gene and protein of Caspase-3， Caspase-9 were detected by Real-time PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， the gene and protein of Caspase-3， Caspase-9 in the model group significantly increased （P<0.01）. TUNNEL observed significant increase of apoptosis. Compared with the model group， the rats in XKG group showed alleviated myocardial apoptosis， and the Caspase-3， Caspase-9 mRNA and protein expression were significantly reduced （P<0.01）. Compared with the control group， the myocardial apoptosis in the XKG group was relatively decreased， and Caspase-3 decreased （P<0.05）. Conclusion XKG has the function of anti-heart failure by regulating and controlling the expression of Caspase-3 and Caspase-9.

〔Keywords〕 myocardial fibrosis; Caspase-3; Caspase-9; chronic heart failure; Xinkang Granule

多種病理因素（如腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、氧化應(yīng)激、致炎細(xì)胞因子、缺血、壓力或容量負(fù)荷過(guò)重、缺氧等）均可使慢性心力衰竭（CHF）誘導(dǎo)出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡[1-2]。心肌凋亡是心衰心臟重構(gòu)（cardiac remodeling， CR）表現(xiàn)形式之一。由半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）家族蛋白介導(dǎo)的心肌凋亡途徑是內(nèi)源性凋亡途徑，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[3]，處于凋亡級(jí)聯(lián)上游，傳遞信號(hào)給下游的Caspase-9從而啟動(dòng)凋亡程序，Caspase-3/-9是經(jīng)典凋亡通路中的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白。

ARB、ACEI類藥物是臨床抗心肌重構(gòu)藥物，由于其相對(duì)適應(yīng)癥、禁忌癥導(dǎo)致藥物使用有一定局限性，因而探討安全有效的抗心肌凋亡中藥顯得尤為迫切。心康沖劑具有健脾滲濕、溫陽(yáng)化氣逐水飲的功效，前期研究顯示其具有抗慢性心力衰竭[4]，并能改善心肌重構(gòu)[5-6]。本研究觀察心康沖劑調(diào)控慢性心力衰竭大鼠Caspase-3、Caspase-9表達(dá)，探討其對(duì)慢性心力衰竭大鼠抗心肌凋亡的作用，為治療心衰提供了新的途徑。

1 材料與儀器

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

58只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，5周齡，體質(zhì)量（160±20） g，購(gòu)于湖南斯克達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：43004700025096）。

1.2 ?藥品及儀器

鹽酸阿霉素（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)），末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT，上海江萊生物）;actin（1∶4 000，Mouse，美國(guó)proteintech），二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（美國(guó)proteintech），HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L） （美國(guó)proteintech），Caspase-3（1∶1 000，Rabbit，美國(guó)CST），Caspase-9（1∶200，Rabbit，美國(guó)proteintech），TUNNL試劑盒（武漢博士德生物公司），免疫組化二抗試劑盒 PV-9000（北京中杉金橋生物公司），引物（上海生工合成），心康沖劑（湖南省中醫(yī)院中藥制劑室制備）。動(dòng)物用彩色多普勒超聲儀（徐州市大為電子設(shè)備有限公司），生物信號(hào)采集系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國(guó)

LEICA），Motic B5顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)），BX43型雙目生物攝像顯微鏡（日本Olympus）。

2 方法

2.1 ?動(dòng)物分組及造模

取大鼠10只為正常組，余下大鼠48只按1.5 mg/kg劑量腹腔注射阿霉素，每周2次，共注射7周，以左心室短軸縮短率<30%[7]為心衰造模成功，造模方法參考文獻(xiàn)[8];再按隨機(jī)數(shù)字表法分為阿霉素對(duì)照組（模型組）16只，心康沖劑1倍等效劑量組16只（心康組），芪藶強(qiáng)心膠囊組（對(duì)照組）16只。

2.2 ?藥物制備及干預(yù)

心康沖劑溶液配制：白參10 g，薏苡仁30 g，大腹皮10 g，黃芪30 g，桔梗5 g，升麻5 g，柴胡5 g，桂枝10 g，茯苓15 g，生姜皮10 g，陳皮10 g，炒白術(shù)10 g，制附片10 g，砂仁6 g。經(jīng)湖南省中醫(yī)院藥劑科制成干燥顆粒后，按成人等效劑量0.5 g/kg配制成濃度為0.6 g/mL的溶液;對(duì)照組給予芪藶強(qiáng)心膠囊溶液，按成人等效劑量（0.06 g/kg），配制為濃度0.073 g/mL。大鼠灌胃劑量按人和動(dòng)物體表面積折算[9]，正常組、模型組予等體積生理鹽水灌服，每日1次，連續(xù)8周。

2.3 ?指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1 ?心臟超聲檢測(cè)心功能 ?10%水合氯醛溶液按3 mL/kg麻醉大鼠后前胸脫毛，超聲診斷儀取大鼠左心室長(zhǎng)軸切面后進(jìn)行M超聲檢測(cè)，測(cè)量左心室短軸縮短率（LVFS）、左室舒張期內(nèi)徑（LVIDd）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），所有數(shù)據(jù)均測(cè)量3次并取其平均值記錄。

2.3.2 ?TUNNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 ?投入10%多聚甲醛溶液固定的大鼠心臟，先后經(jīng)石蠟包埋、切片、透明、脫水、PBS漂洗后，50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記后反應(yīng)10 min。再加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，PBS漂洗、DAPI染色，封片，觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.3.3 ?Real-time PCR法檢測(cè)心肌Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA表達(dá) ?Trizol法提取大鼠心臟組織總RNA，再行RNA的瓊脂糖凝膠電泳。取大鼠左心室心尖部分2 μg，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min離心，冰上冷卻，行定量PCR反應(yīng)。每個(gè)樣本每個(gè)指標(biāo)3個(gè)孔，每孔10 μL。定量PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因的表達(dá)水平。-ΔΔCt=ΔCt對(duì)照組-ΔCt樣品，△Ct=△Ct目的-△Ct內(nèi)參。每個(gè)樣本重復(fù)3次，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

在NCBI上搜索獲得Caspase-3、Caspase-9基因序列，primer5設(shè)計(jì)引物，上海生工合成。引物序列見(jiàn)表1。

2.3.4 ?免疫組化法檢測(cè)心肌Caspase-3、Caspase-9含量 ?心肌標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛液固定、包埋、切片、脫蠟、乙醇脫水后，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;微波修復(fù)抗原2次，冷至室溫，PBS洗，加1∶100一抗Caspase-3、Caspase-9每片50 μL，4 ℃過(guò)夜，加二抗，滴加二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。采用MOTIC圖像分析系統(tǒng)在×400倍光學(xué)顯微鏡下對(duì)Caspase-3、Caspase-9陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行半定量分析;分析每個(gè)視野下各細(xì)胞光密度值，最后取該切片總的平均密度值。

平均光密度值=積分光密度值/所選定視野總面積

2.4 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。全部計(jì)量資料用“x±s”表示，先檢驗(yàn)正態(tài)性，如滿足正態(tài)性，采用單因素方差分析;兩兩比較，方差齊采用方差分析-LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Games-Howell 檢驗(yàn);不滿足正態(tài)性時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?各組大鼠心臟超聲結(jié)果比較

與正常組比較，模型組心臟擴(kuò)大而收縮力下降，表現(xiàn)為L(zhǎng)VIDd增大，而LVFS、LVEF下降（P<0.01）;與模型組比較，對(duì)照組及心康組心腔變小而收縮力增強(qiáng)，LVIDd縮小，LVEF、LVFS升高（P<0.05，P<0.01）;與對(duì)照組比較，心康組LVEF升高（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3.2 ?TUNNEL法觀察細(xì)胞凋亡

400×光鏡下觀察：正常組細(xì)胞核排列規(guī)整、呈藍(lán)色長(zhǎng)梭形。造模后，模型組棕褐色壞死顆粒物質(zhì)明顯增多;與模型組相比，心康組棕褐色壞死顆粒物質(zhì)則明顯減少;與對(duì)照組相比，心康組心肌細(xì)胞凋亡相對(duì)較少。見(jiàn)圖1。

3.3 ?Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA比較

模型組與正常組比，Caspase-3、Caspase-9基因表達(dá)顯著增加（P<0.01），表明凋亡基因增多;心康沖劑干預(yù)后，心康組Caspase-3、Caspase-9基因表達(dá)顯著下降（P<0.01）;與對(duì)照組比，心康組Caspase-3、Caspase-9基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

3.4 ?Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)比較

與正常組比，模型組凋亡蛋白表達(dá)增多，Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01）;經(jīng)心康沖劑、芪藶強(qiáng)心膠囊干預(yù)后，心康組及對(duì)照組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.01）;與對(duì)照組比，心康組caspase-3表達(dá)顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)表4、圖2-3。

4 討論

中醫(yī)學(xué)將慢性心力衰竭類歸于“水腫”“喘證”“心悸”等范疇。中醫(yī)藥治療慢性心力衰竭療效肯定，研究證明，芪藶強(qiáng)心膠囊有抗大鼠心肌細(xì)胞凋亡作用[10-11]。心康沖劑以真武湯、升陷湯及參苓白術(shù)散為基礎(chǔ)方，具有健脾滲濕、溫陽(yáng)化氣逐水飲功效，能有效治療慢性心衰水腫、喘證、心悸等水濕內(nèi)停之證[4]。

細(xì)胞凋亡發(fā)病機(jī)制主要有死亡受體通路、線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路3條途徑。其中由多種生物、理化刺激信號(hào)觸發(fā)形成凋亡體，激活Caspase-9，從而剪切并激活下游的Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，是內(nèi)源性途徑機(jī)制。Caspases介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并參與慢性心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展[12-13]。Caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶[14]。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組心肌凋亡明顯增多，LVIDd明顯升高，而LVFS、LVEF顯著下降，同時(shí)Caspase-3及Caspase-9的核酸及蛋白表達(dá)增加，表明凋亡組織中具有Caspase-3、Caspase-9表達(dá)增加的特征。心康沖劑干預(yù)后，心肌凋亡減輕，LVIDd明顯下降，

LVEF、LVFS明顯升高，表明心康沖劑具有縮小擴(kuò)大的心臟、增強(qiáng)心肌收縮力、提升射血功能。與對(duì)照組比，心康沖劑組使心臟縮小、心功能提高更明顯，并且下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)更明顯，而Caspase-3

mRNA表達(dá)無(wú)差異，表明心康沖劑調(diào)控Caspase-3的mRNA與蛋白表達(dá)呈非一致性，說(shuō)明在調(diào)控Caspase-3的mRNA與蛋白表達(dá)中有其他因素參與;因此，臨床實(shí)踐及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，心康沖劑具有良好的抗心衰竭及抗心肌凋亡作用，臨床值得推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] CONSILI C， GATTA L， IELLAMO F， et al. Severity of left ventricular dysfuction in heart failure patients affects the degree of serum-induced cardiomyocyte apoptosis.Importance of inflammatory response and metabolism[J]. International Journal of Cradiology， 2013，167（6）：2859-2866.

[2] BOFFA G M， ZANINOTTO M， SARTOR R， et al. Interleukin-6 and tumornecrosis factor-alpha as biochemical markers of heart failure： Ahead-to-head clinical comparison with B-type natriuretic peptide[J]. Journal of Cardiovascular Medicine，2009，10（10）：758-764.

[3] KHAN M， ZHENG B， YI F， et al. Pseudolaric acid B induces Caspase dependent and Caspase-independent apoptosis in u87 glioblastoma cells[J]. Evid Based Complementary Alternative Medicine，2012（2012）：957568.

[4] 宋亞妮，譚 ?雄，聶孝平.心康沖劑對(duì)慢性心力衰竭大鼠血漿RAAS的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，21（1）：21-23.

[5] 張 ?輝.心康沖劑對(duì)慢性心力衰竭大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（10）：20-23.

[6] 張 ?輝，聶孝平，毛湘屏，等.心康沖劑對(duì)慢性心衰大鼠AVPmRNA表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，21（14）：70-74.

[7] XU K， GEORGE I， KLOTZ S， et a1. Erythropoietin derivate improvesleft ventricular systolic performance and attenuates left ventricularremodeling in rats with myocardial infarct-induced heart failure[J]. Journal of Cardiovascular Pharmacology， 2010，56（5）：506-512.

[8] 徐建虎，張 ?琦，楊子慶，等.阿霉素誘導(dǎo)大鼠慢性心衰模型的制備[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，3（39）：348-351.

[9] 賀石林，王 ?鍵，王凈凈.中醫(yī)科研設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2006：48.

[10] 林銳波.芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心梗后心衰大鼠心功能及凋亡蛋白caspase-3表達(dá)的影響[D].汕頭：汕頭大學(xué)，2010.

[11] 徐 ?濤，郭麗峰，陳立鋒.芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（4）：366-369.

[12] 劉蓉芳，譚 ?雄，張 ?輝，等.慢性心衰大鼠心肌miRNA-1、iRNA-133/Caspases表達(dá)差異研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（12）：1326-1330.

[13] 陳 ?聰，吳勇軍，喻 ?嶸，等.左歸降糖益腎方含藥血漿對(duì)高糖培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞凋亡及Caspase-12表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（3）：1-4.

[14] LI Q， GUO Y L， LI X， et al. The interference of picroside Ⅱon the expressions of caspase-3 and PARP follwing cerebral ischemia reperfusion injury in rats[J]. Chinese Pharmacological Bulletin， 2010，26（3）：342-345.