響應(yīng)面法優(yōu)化鮑魚發(fā)酵工藝條件

江銘福

摘 要：探索通過接種乳酸菌對鮑魚進行發(fā)酵，抑制發(fā)酵過程有害雜菌生長，降低發(fā)酵鮑魚產(chǎn)品中的亞硝酸鹽含量，提高鮑魚品質(zhì)和食用安全性。通過單因素試驗研究菌種配比、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對發(fā)酵鮑魚氨基酸態(tài)氮含量及亞硝酸鹽含量的影響，以氨基酸態(tài)氮含量和亞硝酸鹽含量為主要指標，應(yīng)用響應(yīng)面回歸分析（RSM），得出乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間影響氨基酸態(tài)氮含量及亞硝酸鹽含量變化趨勢的二次模型方程，在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化得到最佳發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明：鮑魚發(fā)酵的最佳工藝條件為乳酸菌接種量1.78%、發(fā)酵溫度34.5℃、發(fā)酵時間27.2 h。在此發(fā)酵條件下，發(fā)酵鮑魚氨基酸態(tài)氮含量62.29 mg·kg-1，預(yù)測值62.35 mg·kg-1;亞硝酸鹽含量0.48 mg·kg-1，預(yù)測值0.47 mg·kg-1，預(yù)測值與實測值基本相符。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;鮑魚;發(fā)酵工藝;響應(yīng)面法

Abstract：Through inoculating lactic acid bacteria to ferment abalone， the study was explored to inhibit the growth of harmful bacteria in fermentation process， reduce the content of nitrite in fermented abalone products， and improve the quality and food safety of abalones. The single factor experiment was conducted to study the effects of bacteria ratio， inoculation amount of lactic acid bacteria， fermentation temperature and fermentation time on amino nitrogen content and nitrite content of fermented abalones.With the amino nitrogen content and nitrite content as the main indexes，the response surface method （RSM） was used to obtain the quadratic model equation of variation trend of the amino acid nitrogen content and nitrite content that was affected by the inoculation amount of lactic acid bacteria， fermentation temperature and fermentation time. On this basis， the optimal fermentation technology conditions were optimized. The results showed that the optimum conditions for abalone fermentation were 1.78% lactobacillus inoculation， 34.5℃ fermentation temperature and 27.2 h fermentation time. Under this fermentation condition， the amino acid nitrogen content of fermented abalone was 62.29 mg·kg-1， and the predicted value was 62.35 mg·kg-1. The content of nitrite was 0.48 mg·kg-1， and the predicted value was 0.47 mg·kg-1， which was basically consistent with the measured value.

Key words：Lactic acid bacteria; Abalone; Fermentation process; Response surface method

鮑魚是中國傳統(tǒng)的名貴食材，其肉質(zhì)細嫩、鮮味濃郁，位列八大“海珍”之一，是極為珍貴的海產(chǎn)品。鮑魚深加工是水產(chǎn)研究的熱點問題。世界各地都有鹽漬鮑魚的飲食習慣，但鮑魚在鹽漬時會丟失很多營養(yǎng)物質(zhì)，且傳統(tǒng)鹽漬發(fā)酵過程中各種不確定因素導致有害雜菌生長，發(fā)酵過程產(chǎn)生亞硝酸鹽等有害物質(zhì)，影響食用安全性。密更等[1]研究了常見發(fā)酵魚制品中優(yōu)勢乳酸菌種類，得出糟魚、酸魚中的優(yōu)勢乳酸菌為植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、戊糖乳桿菌及戊糖片球菌等;王悅齊等[2]研究干酪乳桿菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌的混合發(fā)酵劑發(fā)酵后帶魚的脂質(zhì)抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對成品的不飽和脂肪酸的氧化有明顯的抑制作用。劉玉等[3]研究降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及其在發(fā)酵魚糜中的初步應(yīng)用，篩選獲得3株具有較高降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌。張弦[4]研究了復合乳酸菌發(fā)酵劑對魚肉香腸品質(zhì)的影響，試驗結(jié)果表明發(fā)酵過程中魚肉香腸的TVBN含量、TBA值和亞硝酸鹽含量顯著降低，氨基態(tài)氮含量顯著升高。柳念等[5]研究總結(jié)純種乳酸菌發(fā)酵比自然發(fā)酵生成的亞硝酸鹽含量低，乳酸菌能夠高效地降解亞硝酸鹽。許女等[6]篩選出高效降解亞硝酸鹽和生物胺活性的植物乳，并將其應(yīng)用在魚肉發(fā)酵香腸中，產(chǎn)品在成熟期間亞硝酸鹽的殘留量和揮發(fā)性鹽基氮的含量均有明顯降低。為了解決傳統(tǒng)鹽漬鮑魚發(fā)酵過程中雜菌生長，亞硝酸鹽含量高的問題，本研究探索通過接種乳酸菌進行人工發(fā)酵加工半干鮑魚，抑制雜菌生長，降低鹽漬鮑魚產(chǎn)品中的亞硝酸鹽含量，在發(fā)酵過程中，鮑魚中的蛋白質(zhì)分解為小分子氨基酸、肽，增加了產(chǎn)品的風味和營養(yǎng)，提高鹽漬鮑魚的品質(zhì)和食用安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 鮑魚、植物乳桿菌、戊糖片球菌、食鹽。

1.1.2 試驗儀器 FA2104電子天平（上海方瑞儀器有限公司）;TE313SDS電子分析天平（德國賽多利斯集團）;DHG9023A電熱恒溫鼓風烘箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）;SWCJ2DD單人雙面凈化工作臺（常州諾基儀器有限公司）;37XEPC生物顯微鏡（上海光學儀器廠）;JLQS1菌落計數(shù)器（精藝興業(yè)科技有限公司）;UV759CRT紫外可見分光光度計（上海佑科儀器公司）;S20K酸度計（梅特勒托利多集團）;DHG9123A高壓滅菌鍋（上海申安集團）;SHP2500生化培養(yǎng)箱（上海精宏有限公司）。

1.2 工藝流程及說明

1.2.1 工藝流程 原料→預(yù)處理→清洗→減菌化處理→接種發(fā)酵→真空包裝→蒸煮→冷卻冷藏→成品

1.2.2 工藝說明 （1）預(yù)處理：新鮮鮑魚經(jīng)去殼、去除內(nèi)臟后進行清洗。（2）清洗：用鹽度2%～3%，溫度為0～7℃的冰鹽水進行清洗，清洗3次，將內(nèi)臟殘留物全部擠出清洗干凈。（3）減菌化處理：將清洗后的鮑魚，放入臭氧水中進行浸泡減菌化處理。（4）發(fā)酵：將減菌化處理的鮑魚與6%食鹽及2%葡萄糖放入滅菌容器中，按比例接種發(fā)酵劑混勻后，置于適宜溫度下密封發(fā)酵。（5）真空包裝：對發(fā)酵腌制后的鮑魚制品立即進行真空包裝;（6）蒸煮：將真空包裝后的鮑魚立即放入蒸煮鍋內(nèi)蒸煮，蒸煮溫度≥95℃，時間≥45 min。（7）冷卻：將蒸煮后的產(chǎn)品放入0℃左右冷卻水降溫30 min以上。（8）冷藏：將冷卻后的鮑魚在0～3℃下儲藏。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗 （1）菌種配比對鮑魚發(fā)酵的影響。在加鹽量為6%，乳酸菌接種量為1.0%、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間為12 h的條件下，植物乳桿菌與戊糖片球菌的菌種配比分別取3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3進行鮑魚鹽漬發(fā)酵試驗，研究菌種配比對鮑魚發(fā)酵的影響。（2）乳酸菌接種量對鮑魚發(fā)酵的影響。在加鹽量為6%，菌種配比為1∶1、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間為12 h的條件下，乳酸菌接種量分別取0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%進行鮑魚發(fā)酵試驗，研究乳酸菌接種量對鮑魚發(fā)酵的影響。（3）發(fā)酵溫度對鮑魚發(fā)酵的影響。在菌種配比為1∶1、乳酸菌接種量為1.0%、發(fā)酵時間為24 h的條件下，發(fā)酵溫度分別取15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃進行發(fā)酵試驗，研究發(fā)酵溫度對鮑魚發(fā)酵的影響。（4）發(fā)酵時間對鮑魚發(fā)酵的影響。在菌種配比為1∶1、乳酸菌接種量為1.0%、發(fā)酵溫度為30℃的條件下，發(fā)酵時間分別取12、16、20、24、28、32 h進行鮑魚發(fā)酵試驗，研究發(fā)酵時間對鮑魚發(fā)酵的影響。

1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計 采用三因素三水平二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，以乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為因素，以氨基酸態(tài)氮含量及亞硝酸鹽含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計與因素水平編碼見表1。

1.4 指標的測定

1.4.1 氨基酸態(tài)氮含量的測定 參照文獻[7]，采用雙指示劑甲醛滴定法進行測定。

1.4.2 亞硝酸鹽含量的測定 參考《GB 5009.33-2010 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[8]，采用鹽酸萘乙二胺法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 菌種配比對鮑魚發(fā)酵的影響 由圖1可知，當植物乳桿菌、戊糖片球菌的菌種配比為1∶2時，氨基酸態(tài)氮含量達到最高，而亞硝酸鹽含量降到最低，可能此配比下兩株乳酸菌之間的協(xié)同發(fā)酵作用最佳。因此，選擇植物乳桿菌、戊糖片球菌的菌種配比為1∶2。

2.1.2 乳酸菌接種量對鮑魚發(fā)酵的影響 由圖2可知，接種量從0增加至1.5%時，發(fā)酵鮑魚的氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升，而亞硝酸鹽含量逐漸下降。乳酸菌接種量增加，有利于乳酸菌定殖成為優(yōu)勢菌，乳酸菌代謝生成的酶類促進蛋白質(zhì)降解，乳酸發(fā)酵產(chǎn)酸有利于鮑魚內(nèi)源酸性蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解[9]。乳酸與亞硝酸鹽結(jié)合生成游離亞硝酸，分解生成NO，乳酸菌將NO2-降解還原成NH4+，NH4+可被乳酸菌利用，合成有機含氮化合物[10-11]，乳酸發(fā)酵抑制了雜菌增殖，減少了雜菌的胺化和硝化作用生成亞硝酸鹽[12]。當接種量超過1.5%后，亞硝酸鹽含量的降低趨于平緩。綜合分析，本試驗選擇乳酸菌接種量1.5%～2.0%為優(yōu)化試驗的水平范圍。

2.1.3 發(fā)酵溫度對鮑魚發(fā)酵的影響 由圖3可知，發(fā)酵溫度由15℃升高到30℃時，鮑魚的氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，亞硝酸鹽含量逐漸降低。當發(fā)酵溫度在30～35℃范圍內(nèi)時，氨基酸態(tài)氮含量維持在較高水平，亞硝酸鹽含量達到較低值。因此選擇優(yōu)化的發(fā)酵溫度范圍為30～35℃。

2.1.4 發(fā)酵時間對鮑魚發(fā)酵的影響 由圖4結(jié)果可以看出，當發(fā)酵時間由12 h延長至28 h時，鮑魚的氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，亞硝酸鹽含量逐步下降。但當發(fā)酵時間在24～32 h，氨基酸態(tài)氮含量和亞硝酸鹽含量變化幅度不大，因此選擇優(yōu)化的發(fā)酵時間范圍為24～28 h。

2.2 響應(yīng)面RSM分析及工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果 采用三因素三水平二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，以接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為因素，以氨基酸態(tài)氮含量及亞硝酸鹽含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析試驗。

2.2.2 數(shù)學回歸模型的建立 運用國際權(quán)威的SASVersion8.1數(shù)據(jù)處理軟件對響應(yīng)面回歸（RSREG）過程進行數(shù)據(jù)的擬合分析[13]，根據(jù)回歸方程Y=a0+ΣaiXi+ΣaijXiXj+ΣXii2建立了接種量（X1）、發(fā)酵溫度（X2）和發(fā)酵時間（X3）影響氨基酸態(tài)氮含量（Y1）及亞硝酸鹽含量（Y2）變化趨勢的二次響應(yīng)數(shù)學模型：

對氨基酸態(tài)氮Y1的模型方程進行失擬和回歸F檢驗，結(jié)果表明：F失擬=3.180.90，校正決定系數(shù)R2=0.9373>0.90，模型方程擬合程度高。

對亞硝酸鹽含量Y2的模型方程進行失擬和回歸F檢驗，結(jié)果表明：F失擬=2.160.90，校正決定系數(shù)R2=0.9840>0.90，模型方程與響應(yīng)值之間具有高度擬合性;綜上所述，數(shù)據(jù)模型擬合狀況良好，試驗誤差小，可以用來對Y1（氨基酸態(tài)氮含量）和Y2（亞硝酸鹽含量）進行分析預(yù)測。

2.2.3 因子主次效應(yīng)分析 通過對Y1回歸模型的各試驗因子系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果表明：X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X2及X2X3的回歸系數(shù)均呈顯著水平，僅X1X3項影響不顯著，剔除不顯著項，簡化Y1回歸模型方程為：

Y1=61.089-0.486095X1-1.481128X2+2.74912X3-2.788139X12+0.63875X1X2-0.882483X22 +0.63625X2X3-2.199473X32

通過對Y2回歸模型的各試驗因子系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果表明：X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X3及X2X3的回歸系數(shù)均呈顯著水平，僅X1X2項影響不顯著，剔除不顯著項，簡化Y2回歸模型方程為：

Y2=0.569975+0.02889X1+0.103976X2-0.18988X3+0.177014X12-0.035X1X3+0.05327X22-0.0425X2X3+0.129284X32

2.2.4 因子交互效應(yīng)分析 將模型方程一個因素固定于零水平，應(yīng)用SAS軟件按照所得的二元二次回歸模型方程對其余因素進行分析運算，得到關(guān)于兩因素交互作用的響應(yīng)曲面分析立體圖。

2.2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化及驗證 （1）氨基酸態(tài)氮含量最優(yōu)條件。根據(jù)回歸模型構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，利用RSREG程序獲得氨基酸態(tài)氮含量響應(yīng)值的穩(wěn)定點。（2）亞硝酸鹽含量最優(yōu)條件。根據(jù)回歸模型構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，利用RSREG 程序獲得亞硝酸鹽含量響應(yīng)值的穩(wěn)定點。

氨基酸態(tài)氮含量與亞硝酸鹽含量的編碼最優(yōu)水平差距為：△X1=0.043745、△X2=-0.02439、△X3=0.053715，未編碼最優(yōu)水平差距為：△X1=0.073579、△X2=-0.04103、△X3=0.090348，這表明發(fā)酵過程中，氨基酸態(tài)氮含量與亞硝酸鹽含量的最優(yōu)工藝條件契合度很高，綜合兩個指標，并結(jié)合實際情況考慮，最后確定鮑魚接種乳酸菌發(fā)酵的工藝條件為：接種量1.78%、發(fā)酵溫度34.5℃、發(fā)酵時間27.2 h。在此發(fā)酵條件下，發(fā)酵鮑魚氨基酸態(tài)氮含量62.29 mg·kg-1，預(yù)測值62.35 mg·kg-1;亞硝酸鹽含量0.48 mg·kg-1，預(yù)測值0.47 mg·kg-1，預(yù)測值與實測值基本相符，驗證了模型分析的可靠性，說明優(yōu)化后的鮑魚發(fā)酵工藝合理可行。

3 結(jié)論

通過接種乳酸菌對鮑魚進行發(fā)酵，能夠有效抑制鮑魚發(fā)酵過程有害雜菌生長，降低發(fā)酵鮑魚產(chǎn)品中的亞硝酸鹽含量，提高鮑魚品質(zhì)和食用安全性。本試驗通過單因素試驗及響應(yīng)面回歸分析，以氨基酸態(tài)氮含量和亞硝酸鹽含量為主要指標，優(yōu)化得到鮑魚最佳發(fā)酵工藝條件為乳酸菌接種量1.78 %、發(fā)酵溫度34.5℃、發(fā)酵時間27.2 h。進一步驗證試驗，數(shù)據(jù)基本吻合，也就是本試驗范圍內(nèi)建立的模型準確有效，可用來預(yù)測鮑魚發(fā)酵工藝參數(shù)，得到的發(fā)酵鮑魚營養(yǎng)豐富，口感和風味俱佳，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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（責任編輯：柯文輝）