纖維素納米晶體提升柚皮素抗氧化活性的研究

劉艷新 李湘洲 周軍 劉慶堅(jiān) 韓俊源 王玥 王玉瓏

摘要： 柚皮素是一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性，具有抗炎、抗氧化、抗癌、降血脂等藥理作用。然而，柚皮素在水中溶解性能差，生物利用度低，限制了其在臨床中的應(yīng)用。本研究以纖維素納米晶體（Cellulose nanocrystals，CNCs）為載體，以柚皮素為疏水藥物模型，利用反溶劑重結(jié)晶法成功制備了CNCs/柚皮素納米復(fù)合物，并表征了所得納米復(fù)合物的性能，分析了納米復(fù)合物中柚皮素的溶出性能和抗氧化活性。結(jié)果表明，形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物后，柚皮素得到充分的納米化和穩(wěn)定分散，從結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型態(tài)。負(fù)載CNCs的柚皮素在水中的溶出性能得到顯著提升，120 min時(shí)累積溶出度達(dá)到93.4%;經(jīng)CNCs負(fù)載后，當(dāng)柚皮素濃度為50 μg/mL時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)44.3%，柚皮素的體外抗氧化活性顯著提高。

關(guān)鍵詞：纖維素納米晶體;柚皮素;納米化;溶解性能;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS721;TB324? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.11980/j.issn.0254-508X.2019.09.002

Abstract： As a typical flavonoid， naringenin exhibits attractive pharmacological activities， including anti-inflammatory， anti-oxidation， anti-cancer properties， and lowering lipids. However， due to its poor water solubility and low bioavailability in aqueous solutions， the pharmaceutical application of naringenin is very limited. In this study， cellulose nanocrystals （CNCs） were used as carriers for naringenin， and the CNCs/naringenin nanocomposite was prepared based on anti-solvent recrystallization method. The CNCs/naringenin nanocomposite was characterized and its dissolution and anti-oxidation activity in aqueous systems were investigated. The results showed that naringenin was effectively nanolized and well dispersed， as well as transformed from crystalline state to amorphous state in aqueous system based on the formation of CNCs/naringenin nanocomposite. The cumulative dissolution of naringenin in CNCs/naringenin nanocomposite obviously increased to 93.4% at 120 min. Furthermore， the in vitro anti-oxidation activity of naringenin was clearly enhanced based on the formation of CNCs/naringenin nanocomposite. The above results supported the conclusion that the use of CNCs as nanocarriers for naringenin was a promising technique to improve the bioavailability of naringenin in aqueous systems.

Key words： cellulose nanocrystals; naringenin; nanolization; dissolution; anti-oxidation

柚皮素（4，5，7-三羥黃烷酮）是一種黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物中，如柚子、西紅柿、葡萄及柑橘類水果等[1-3]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。研究表明，柚皮素具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、降血脂等藥理作用[4-7]。然而，柚皮素的水溶性極低，口服制劑溶出速率緩慢，口服生物利用度僅為5.81%，極大地限制了柚皮素在臨床中的應(yīng)用[8]。目前，研究工作者嘗試采用多種方法提高柚皮素的生物利用度，Shulman等人[9]制備了羥丙基-β-環(huán)糊精/柚皮素復(fù)合物，顯著提升了柚皮素在水中的溶解速率及在小鼠體內(nèi)的生物利用度;Khan等人[10]采用固態(tài)分散技術(shù)，將柚皮素進(jìn)行納米化處理，提高了柚皮素的體外釋放效果及體內(nèi)藥理活性。Shpigelman等人[11]和Wang等人[12]分別以β-乳球蛋白和脂質(zhì)體作為納米載體，對(duì)柚皮素進(jìn)行負(fù)載，從而提高了柚皮素的溶出性能及體外和體內(nèi)的藥理活性。

近年來(lái)，以天然可降解生物質(zhì)材料為原料制備藥物載體引起了研究者的高度關(guān)注。纖維素納米晶體（Cellulose Nanocrystals，CNCs）是對(duì)植物纖維原料進(jìn)行物理、化學(xué)、物理/化學(xué)、酶水解等處理而獲得的一種新型納米材料[13-14]，其長(zhǎng)度一般為100～500 nm，寬度5～20 nm[15-16]。由于其具有可再生、可生物降解、無(wú)毒、化學(xué)修飾性高等優(yōu)勢(shì)，CNCs在藥物載體制備中顯示出巨大潛力[17]。Jackson等人[18]對(duì)CNCs進(jìn)行疏水改性后用于負(fù)載水不溶性抗癌藥物，如紫杉醇、多西他賽、依托泊苷等，取得了良好的藥物緩釋和控釋效果。Mohanta等人[19]制備了CNCs基微膠囊和膜材料并用于負(fù)載姜黃素，提升了姜黃素的生物利用度和分散性。You等人[20]將陽(yáng)離子CNCs和纖維素通過(guò)β-甘油磷酸酯交聯(lián)反應(yīng)后制備了可注射水凝膠，負(fù)載阿霉素后的水凝膠在小鼠體內(nèi)展現(xiàn)出良好的藥物緩釋作用及抗肝癌效果。

本研究以CNCs為載體，以柚皮素為疏水性藥物模型，通過(guò)反溶劑重結(jié)晶法將柚皮素負(fù)載于CNCs上，形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物。利用紅外光譜儀、透射電子顯微鏡、X射線衍射儀等對(duì)CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的性能進(jìn)行表征;并對(duì)負(fù)載前后柚皮素的溶出性能和抗氧化活性（羥基自由基清除法）進(jìn)行分析，以期為CNCs在疏水性藥物負(fù)載中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

纖維素納米晶體（CNCs），采用硫酸水解油茶果殼纖維制得，長(zhǎng)度80～350 nm，寬度5～25 nm，Zeta 電位-38 mV;柚皮素（純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（PBS）、水楊酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇等，國(guó)藥集團(tuán)（北京）化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，上海力辰儀器科技有限公司）;超聲波細(xì)胞破碎儀（HUP-100，天津恒康機(jī)械設(shè)備有限公司）;真空冷凍干燥機(jī)（FD-1A-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;紫外可見分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限公司）;傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，Nicolet iS5，美國(guó)Thermo fisher儀器公司）;透射電子顯微鏡（TEM，JEM-2010，日本電子株式會(huì)社）;X射線衍射儀（XRD，D8 Advance，德國(guó)布魯克公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的制備

將100 mg冷凍干燥的油茶果殼CNCs置于燒杯中，加入100 mL去離子水，經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎儀分散10 min后，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.1%的油茶果殼CNCs分散液，備用。一定量的柚皮素原料溶于無(wú)水乙醇中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的柚皮素?zé)o水乙醇溶液。在磁力攪拌及冰水浴條件下，將2 mL柚皮素?zé)o水乙醇溶液（1 mg/mL）逐滴加入20 mL 0.1%的油茶果殼CNCs分散液中;滴加完畢后，繼續(xù)攪拌15 min，獲得CNCs/柚皮素納米復(fù)合物懸浮液，冷凍干燥，備用。

對(duì)照樣的制備：取2 mL柚皮素?zé)o水乙醇溶液? ?（1 mg/mL）逐滴加入20 mL去離子水中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌15 min，制得無(wú)CNCs載體的柚皮素顆粒，標(biāo)記為反溶劑重結(jié)晶柚皮素顆粒。

1.3.2 CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的性能表征

FT-IR分析：冷凍干燥后的試樣使用Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行分析，掃描范圍400～4000 cm-1，分辨率為 4 cm-1。

TEM分析：待測(cè)試樣用去離子水稀釋至質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL，滴于專用銅網(wǎng)試樣臺(tái)上，在室溫下風(fēng)干24 h。采用透射電子顯微鏡對(duì)風(fēng)干后的試樣進(jìn)行觀測(cè)（加速電壓200 kV）。

XRD分析：冷凍干燥后的樣品采用X射線衍射儀進(jìn)行分析;測(cè)試條件：Cu，Kα輻射（λ=1.54）產(chǎn)生X射線，加速電壓40 kV，2θ掃描范圍3°～50°，掃描速度0.02 °/s。

1.3.3 累積溶出度測(cè)定

柚皮素的累積溶出度測(cè)定參考Kocbek等報(bào)道的方法[21]，具體測(cè)定步驟在該文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上略微改進(jìn)，累積溶出度按照公式（1）計(jì)算[22]。具體步驟如下：將含柚皮素2 mg的試樣置于100 mL PBS緩沖溶液中（pH值=7.4），控制水浴溫度為（37±0.5）℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min。分別于5、10、20、40、60、80、100、120 min 取樣5 mL，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液采用紫外可見分光光度計(jì)在290 nm波長(zhǎng)下測(cè)定柚皮素的吸光度。每次取完5 mL試樣后，立刻補(bǔ)充同體積等溫新鮮PBS介質(zhì)，以維持總釋放體積不變（每次取樣和補(bǔ)充新鮮介質(zhì)操作在30 s內(nèi)完成）。根據(jù)事先標(biāo)定的柚皮素標(biāo)準(zhǔn)溶出曲線及吸光度結(jié)果，計(jì)算溶出介質(zhì)中溶出柚皮素的質(zhì)量，并繪制柚皮素累積溶出曲線。

1.3.4 體外抗氧化活性測(cè)定

試樣的體外抗氧化活性分析通過(guò)測(cè)定其羥基自由基（·OH）清除率的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考Smirnoff等報(bào)道的水楊酸羥基化法[23]。本方法采用Fenton氧化反應(yīng)產(chǎn)生·OH，然后采用水楊酸對(duì)·OH進(jìn)行捕捉。氧化反應(yīng)體系由150 mmol/L PBS緩沖溶液（pH值=7.4），0.15 mmol/L Fe3+-EDTA，2 mmol/L水楊酸，0.26 mmol/L抗壞血酸，0.6 mmol/L H2O2和待測(cè)樣品組成。氧化反應(yīng)體系在（37±0.5）℃下培育100 min，采用紫外可見分光光度計(jì)在530 nm處測(cè)定反應(yīng)體系吸光度，·OH清除率根據(jù)公式（2）計(jì)算。

式中，為空白試樣的吸光度，表示產(chǎn)生的總羥基自由基數(shù)量;為加入含柚皮素試樣后體系的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 FT-IR分析

柚皮素、CNCs和CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的FT-IR分析結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，柚皮素在3021、1630、1590和1510 cm-1處出現(xiàn)的特征吸收峰，分別來(lái)源于酚羥基振動(dòng)、羰基振動(dòng)和苯環(huán)振動(dòng)。Semalty等人[24]在研究中也報(bào)道了相似的柚皮素FT-IR特征吸收峰。CNCs在3320、2890、1050和1030 cm-1處出現(xiàn)的特征吸收峰，分別來(lái)源于羥基振動(dòng)、碳?xì)滏I振動(dòng)、仲醇羥基和伯醇羥基振動(dòng)，與其他來(lái)源的CNCs具有高度的吻合性[25-27]。當(dāng)形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物后，CNCs中3320 cm-1處的羥基吸收峰及1050和1030 cm-1處的仲醇羥基和伯醇羥基的吸收峰強(qiáng)度顯著增加，分析認(rèn)為這是由于柚皮素分子中的酚羥基和CNCs中的羥基相互作用形成新氫鍵的原因。同時(shí)，CNCs/柚皮素納米復(fù)合物中也能夠觀察到柚皮素的部分特征峰，表明柚皮素成功負(fù)載于CNCs表面。

2.2 TEM分析

柚皮素、CNCs、反溶劑重結(jié)晶柚皮素顆粒及CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的表面形貌如圖3所示。從圖3可以看出，柚皮素呈現(xiàn)為晶體形態(tài)，尺寸大，寬度接近2 μm（見圖3（a））;實(shí)驗(yàn)分散過(guò)程中發(fā)現(xiàn)柚皮素很難潤(rùn)濕，大部分漂浮于去離子水表面，這是由柚皮素的強(qiáng)疏水性引起的。經(jīng)過(guò)反溶劑重結(jié)晶處理后，柚皮素變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)規(guī)則的針狀顆粒，長(zhǎng)度約1～1.5 μm，寬度約100～250 nm（見圖3（c））;形成反溶劑重結(jié)晶顆粒后，柚皮素在水中的分散性和穩(wěn)定性得到改善，但室溫放置24 h后，體系穩(wěn)定性下降，出現(xiàn)柚皮素顆粒絮團(tuán)。而形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物后，針狀柚皮素顆粒消失，轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型態(tài)的柚皮素顆粒，均勻分散在CNCs體系中（見圖3（d）），實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CNCs/柚皮素納米復(fù)合物懸浮液的分散性和穩(wěn)定性良好，室溫放置72 h無(wú)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。

2.3 XRD分析

柚皮素、CNCs、反溶劑重結(jié)晶柚皮素顆粒和CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的XRD分析如圖4所示。從圖4可以看出，柚皮素在2θ=10.76°、15.92°、17.24°、18.15°、19.90°、20.52°、22.20°、23.80°、24.43°、25.34°和27.71°處存在強(qiáng)烈的衍射峰，表明柚皮素處于高度結(jié)晶態(tài)。反溶劑重結(jié)晶處理形成的柚皮素顆粒在2θ=10.76°、15.92°、18.15°、20.52°、22.20°、25.34°存在XRD衍射峰，但衍射峰的強(qiáng)度相比柚皮素顯著降低，表明反溶劑重結(jié)晶處理降低了柚皮素的結(jié)晶度。而形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物后，柚皮素的XRD衍射峰全部消失，表明柚皮素完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型態(tài)，分析認(rèn)為柚皮素負(fù)載于CNCs上后柚皮素被充分的納米化是其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型態(tài)的主要原因。據(jù)研究報(bào)道，疏水藥物的納米化有助于提高其比表面積和在水中的溶出性能，從而提高其生物利用度[28]。

2.4 累積溶出度分析

柚皮素、反溶劑重結(jié)晶柚皮素顆粒和CNCs/柚皮素納米復(fù)合物中柚皮素的累積溶出度如圖5所示。? 從圖5可以看出，柚皮素在水中的累積溶出度非常低，120 min時(shí)累積溶出度僅為1.7%。經(jīng)過(guò)反溶劑重結(jié)晶處理形成柚皮素顆粒后，柚皮素的累積溶出度增加，120 min時(shí)累積溶出度達(dá)到34.7%，這是因?yàn)榉慈軇┲亟Y(jié)晶過(guò)程中柚皮素被顆?；?，比表面積增加，因而提高了其溶出性能。

相比之下，形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物后，柚皮素的累積溶出度得到顯著提升，在10 min時(shí)累積溶出度即可達(dá)到52.7%，120 min時(shí)達(dá)到93.4%。這是因?yàn)殍制に刎?fù)載于CNCs上后，柚皮素被充分納米化和穩(wěn)定分散。研究表明，疏水性藥物在水中的溶出度和其生物利用度具有良好的相關(guān)性，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了通過(guò)提高姜黃素、槲皮素、金雀異黃酮等疏水性藥物在水中的溶出性能而顯著提高藥物生物利用度方面的研究[22，29-30]。

2.5 體外抗氧化性能

羥基自由基（·OH）是活性氧的一種。研究表明，·OH在人體內(nèi)含量大時(shí)危害最嚴(yán)重，許多疾病的產(chǎn)生均與·OH有較高的相關(guān)性，如癌癥、糖尿病、動(dòng)脈硬化及其他炎癥等。目前，檢測(cè)·OH清除率是評(píng)價(jià)藥物抗氧化性能的主要方法之一。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)柚皮素、反溶劑重結(jié)晶柚皮素顆粒及CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的·OH清除率進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。

從圖6可以看出，柚皮素的·OH清除率很低，柚皮素濃度為50 μg/mL時(shí)，·OH清除率僅為4.1%，表明柚皮素的藥理活性很難得到發(fā)揮。經(jīng)過(guò)反溶劑重結(jié)晶形成柚皮素顆粒后，·OH清除率增加，濃度為50 μg/mL時(shí)，·OH清除率為12.6%。而形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物后，柚皮素的·OH清除率顯著提升;在濃度為10 μg/mL時(shí)，·OH清除率為25.6%，濃度為50 μg/mL時(shí)，·OH清除率達(dá)到44.3%。以上結(jié)果表明，柚皮素負(fù)載在CNCs上后，體外抗氧化性能得到顯著提升。

3 結(jié) 論

本研究以纖維素納米晶體（CNCs）為載體，以柚皮素為水不溶性藥物模型，通過(guò)反溶劑重結(jié)晶法將柚皮素負(fù)載于CNCs上，形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物。并對(duì)所制得的CNCs/柚皮素納米復(fù)合物進(jìn)行了性能表征，評(píng)估了負(fù)載前后柚皮素的溶出性能及體外抗氧化活性。

3.1 透射電子顯微鏡（TEM）和X射線衍射（XRD）的分析結(jié)果表明，形成CNCs/柚皮素納米復(fù)合物后，柚皮素被充分納米化和穩(wěn)定分散，柚皮素從結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型態(tài)。

3.2 CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的形成，使柚皮素在水中的溶出性能顯著提升，120 min時(shí)累積溶出度達(dá)到93.4%;而同樣條件下，柚皮素和反溶劑重結(jié)晶的柚皮素顆粒的累積溶出度僅為1.7%和34.7%。

3.3 CNCs/柚皮素納米復(fù)合物的形成，柚皮素的體外抗氧化性能顯著提高，當(dāng)CNCs/柚皮素納米復(fù)合物濃度為50 μg/mL時(shí)，·OH清除率達(dá)到44.3%;而同樣濃度下，柚皮素和反溶劑重結(jié)晶柚皮素顆粒的·OH清除率僅為4.1%和12.6%。

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（責(zé)任編輯：黃 舉）