萬壽菊雄性不育系離體快繁體系的建立

吳麗芳 趙艷 廖春方 錢紹方 桂寶林

摘要：【目的】建立色素萬壽菊雄性不育系離體快繁體系，為開展萬壽菊育種研究和雜交制種打下基礎?！痉椒ā恳?個色素萬壽菊母本資源（B1-1、B1-3、B1-4和Bnm）雄性不育株的葉片和莖段為外植體，以不同生長調節(jié)劑組合對其進行愈傷組織誘導、不定芽分化及生根培養(yǎng)，建立適宜色素萬壽菊離體快繁的技術體系?！窘Y果】以葉片為外植體的各色素萬壽菊雄性不育株再生能力均較以莖段為外植體的再生能力強，其愈傷組織誘導率和不定芽分化率排序均為B1-3>B1-1>Bnm>B1-4;適宜B1-3和B1-1葉片愈傷組織誘導的培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA），誘導率分別為99.2%和95.3%;適宜莖段愈傷組織誘導的培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA，其中B1-3和B1-1的誘導率較高，分別為81.4%和80.1%。萘乙酸（NAA）與玉米素（ZT）組合誘導4個不同色素萬壽菊的愈傷組織不定芽分化率普遍高于NAA與6-BA組合，其中B1-3葉片和莖段的愈傷組織在MS+1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L ZT中的不定芽分化效果較佳，分化率分別達72.5%和57.7%。適宜色素萬壽菊不定芽生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA，其中B1-3和Bnm的生根率均達100.0%;再生植株移栽成活率達95.0%?！窘Y論】葉片是誘導色素萬壽菊雄性不育系植株再生的良好材料，B1-3是獲得色素萬壽菊離體培養(yǎng)雄性不育植株最佳的母本資源;建立的色素萬壽菊雄性不育系離體快繁體系可為其育種研究和雜交種種子生產提供資源保障。

關鍵詞： 色素萬壽菊;離體快繁體系;母本資源;植物生長調節(jié)劑;植株再生

中圖分類號： S682.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A? ? ? ?文章編號：2095-1191（2019）09-2029-07

Abstract：【Objiective】Establishing in vitro rapid propagation system of male sterile lines of Tagetes erecta L. to provide foundation for breeding research and hybrid seed production. 【Method】The leaves and stem segments from four mother resources male sterile plants（B1-1、B1-3、B1-4 and Bnm） of T. erecta were used as explants，and the callus induction，adventitious bud differentiation and rooting culture were conducted with different combinations of growth regulators to establish a sui table technical system for in vitro rapid propagation of T. erecta. 【Result】The regeneration ability of T. erecta with leaf as explants was stronger than that of stem segment，the rate of callus induction and adventitious bud differentiation were ranked B1-3>B1-1>Bnm>B1-4. The suitable medium for callus induction of leaves for B1-3 and B1-1 was MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-benzylaminoadenine（6-BA），and the rates of callus induction were 99.2% and 95.3% respectively. The suitable medium for callus induction of stem segments was MS+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA，among them，B1-3 and B1-1 had higher induction rates，which were 81.4% and 80.1% respectively.The combination of nafusaku（NAA） and zeatin（ZT） for inducing adventitious bud differentiation rate was generally higher than that of the combination of NAA and 6-BA in four different T. erecta. Among them，rate of adventitious bud differentiation of leaves and stem segments of B1-3 was better in MS+1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L ZT，which were 72.5% and 57.7%，respectively. 1/2MS+0.5 mg/L NAA was suitable for rooting. The rooting rates of B1-3 and Bnm reached 100.0%. The survival rate of regeneration plants was up to 95.0%. 【Conclusion】The leaves are fit for inducing regeneration plant of T. erecta male sterile line. B1-3 is the best female resource to obtain male sterile plants for in vitro culture. Establishment of in vitro rapid propagation system of T. erecta can provide foundation resources for its breeding and hybrid seed production.

Key words： Tagetes erecta L.; in vitro rapid propagation system; female resources; plant growth regulator; plant regeneration

0 引言

【研究意義】色素萬壽菊（Tagets erecta L.）為菊科萬壽菊屬草本植物，其花瓣是提取葉黃素的最佳植物性原料。從萬壽菊屬植物中提取的葉黃素最早主要作為著色劑應用于飼料中以提高禽蛋的色澤和營養(yǎng)品質，之后作為抗氧化劑在醫(yī)藥、食品、保健品及化妝品領域應用（Dwyer et al.，2001;Granado et al.，2003），市場需求量逐年加大。萬壽菊雜交育種常利用雄性不育兩用系不育系作母本，與強優(yōu)勢的恢復系作父本配制雜交種（田海燕，2007），但在不育性的保持中，需利用兩用系姊妹交保持不育性，較難獲得不育株。因此，通過離體繁殖保存萬壽菊雄性不育材料，對有效開展萬壽菊雄性不育理論研究及拓寬其雜交制種原材料供給途徑具有重要意義。【前人研究進展】國內外學者對萬壽菊離體繁殖進行了許多研究。Bespalhok和Hattori（1998）以萬壽菊子葉為外植體得到胚性愈傷組織并形成體胚，但最終未獲得再生植株。蘇福才等（1999）、田廣紅（2001）以萬壽菊腋芽或帶腋芽莖段為外植體，建立了萬壽菊離體擴繁體系。Vanegas等（2002）以萬壽菊莖段、胚軸和葉片為外植體進行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)葉片的離體培養(yǎng)效果最佳。Kumar等（2004）、伍亞平和唐道誠（2013）建立了萬壽菊雄性不育系植株的再生體系。林淦和周建平（2006）、趙子剛等（2010）以萬壽菊葉片為外植體進行離體培養(yǎng)獲得了再生植株。李甫等（2007）以萬壽菊花藥為外植體，獲得了單倍體再生植株。孫嬋娟（2009）、曾水玉（2012）以萬壽菊莖段為外植體，探討其試管苗開花途徑。石虹梅和俞明月（2017）對比以菊花帶芽莖段、節(jié)間中段及葉片為外植體的組織培養(yǎng)效果，發(fā)現(xiàn)節(jié)間中段的脫分化、再分化過程明顯且成功率高?！颈狙芯壳腥朦c】色素萬壽菊離體培養(yǎng)過程中褐化、玻璃化及污染嚴重仍是難以解決的問題，由于其雄性不育植株取材時間具有特殊性，因此其離體快繁難度較大，如在萬壽菊育種實踐中只有待植株現(xiàn)蕾后才能區(qū)分雄性不育母本資源的可育植株和不育植株，但目前關于通過離體快繁收集并保存不同基因型色素萬壽菊不育植株、擴繁母本資源、建立遺傳穩(wěn)定性一致優(yōu)良繁育體系的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以4個不同基因型色素萬壽菊母本資源現(xiàn)蕾5～10 d不育植株相對幼嫩的葉片和莖段為外植體，采用正交試驗，分析2，4-D與6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）組合對其愈傷組織誘導、萘乙酸（NAA）與6-BA和NAA與玉米素（ZT）組合對不定芽分化及NAA對生根的影響，旨在建立色素萬壽菊雄性不育系離體快繁體系，短期內繁殖并保存大量遺傳穩(wěn)定一致的雄性不育母本資源，為開展色素萬壽菊育種研究和雜交制種提供資源保障。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試色素萬壽菊雜交母本資源B1-1、B1-3、B1-4和Bnm（均由內蒙古赤峰市喀喇沁旗科學技術協(xié)會張永強老師提供，其他信息見表1）雄性不育株的幼嫩葉片和莖段采自云南省曲靖博浩生物科技股份有限公司大棚現(xiàn)蕾1～5 d的色素萬壽菊植株。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 外植體表面消毒 將采集的葉片和莖段經流水沖洗30 min后，用75%酒精浸泡30 s，再用1.0 g/L HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗4～6次后，無菌濾紙吸干外植體表面水分。接種時剪掉葉片的葉尖和基部，切成0.5 cm×0.5 cm小塊;莖段切成長0.5～1.0 cm小段。1%檸檬酸無菌液浸泡數秒后接種于誘導培養(yǎng)基。

1. 2. 2 愈傷組織誘導及增殖 采用正交試驗設計篩選愈傷組織誘導培養(yǎng)基，設2因子4水平共16個處理（處理 I1～I16）（表2）。每處理接種6瓶，每瓶接種萬壽菊材料3～5個，重復3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。增殖培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+2.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂，pH 5.8，每20～25 d增殖培養(yǎng)1次，共培養(yǎng)2次。培養(yǎng)條件：愈傷組織誘導先暗培養(yǎng)10 d，然后以10.0 mmol/（m2·s）光照進行光培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)時以光照強度15.0 mmol/（m2·s）進行培養(yǎng)，14 h/d;溫度（25±1）℃。

愈傷組織誘導率（%）=誘導愈傷組織數/接種外植體數×100

1. 2. 3 不定芽分化 增殖良好的愈傷組織接種于不定芽分化培養(yǎng)基中進行不定芽分化。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度（0.5和1.0 mg/L）NAA、（0.5、1.0、2.0和3.0 mg/L）6-BA、（0.5、1.0、2.0和3.0 mg/L）ZT、30.0 g/L蔗糖和7.0 g/L瓊脂（具體組合見表2和表3），pH 5.8。每個組合接種6瓶，每瓶接種愈傷組織3～4塊，重復3次，培養(yǎng)25～30 d后統(tǒng)計不定芽分化率。培養(yǎng)條件：光照20.0 mmol/（m2·s），14 h/d;溫度（25±1）℃。

不定芽分化率（%）=分化出芽的愈傷組織數/接種愈傷組織數×100

1. 2. 4 生根培養(yǎng) 分化得到的不定芽轉入1/2MS和MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，分別添加0～0.5 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂+2.0 g/L活性炭，pH 5.8。生根培養(yǎng)條件：光照30.0 mmol/（m2·s），14 h/d，溫度（25±1）℃。待根長達5.0 cm 時，將生根植株煉苗5 d，移栽至裝有腐殖土的花盆中，移栽后10 d內，用80%遮陽網遮光避免陽光直曬，之后每天增加直曬時間，每一母本資源移栽50株，30 d后統(tǒng)計成活率。

生根率（%）=生根苗數/接種苗數×100

移栽成活率（%）=移栽成活的植株數/移栽的總株數×100

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數據采用Excel 2007進行統(tǒng)計，以SPSS 19.0進行方差分析。

2 結果與分析

2. 1 色素萬壽菊外植體愈傷組織誘導情況

不同基因型色素萬壽菊母本資源的外植體接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基5～7 d，各處理的葉片開始皺縮、卷曲，邊緣出現(xiàn)白色或淡黃綠色愈傷組織（圖1-A），10～20 d為愈傷組織快速變大期（圖1-B），25 d后愈傷組織幾乎停滯生長，需及時對愈傷組織進行轉接，以防其褐化;以莖段為外植體誘導產生的愈傷組織比以葉片為外植體誘導的稍滯后，愈傷組織先從兩端切口長出（圖1-C），愈傷組織的質地也以莖段誘導的比以葉片誘導的緊實，在較高的2，4-D濃度下莖段上有根長出（圖1-D）。說明不同外植體啟動脫分化時間、形成愈傷組織的質地和形態(tài)存在差異。

2. 2 不同生長調節(jié)劑對色素萬壽菊愈傷組織誘導的影響

由表2可知，以同一母本資源色素萬壽菊的葉片和莖段為外植體，葉片的愈傷組織誘導率均明顯高于莖段;B1-3、B1-1和Bnm葉片的愈傷組織誘導率均在80.0%以上，而B1-4葉片的愈傷組織誘導率總體上均較低;4個母本資源葉片的愈傷組織誘導率總體上表現(xiàn)為B1-3>B1-1>Bnm>B1-4，其中B1-3和B1-1以I13處理（即2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA）的愈傷組織誘導效果最佳，分別為99.2%（B1-3葉片I16處理的愈傷組織誘導率也為99.2%，但誘導的愈傷褐化率較I13處理高，愈傷的誘導質量比I13處理差）和95.3%;以莖段為外植體進行愈傷組織誘導時，4個色素萬壽菊母本資源的愈傷組織誘導效果均以I16處理（即2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA）最佳，其中又以B1-1和B1-3的誘導率較高，分別為80.1%和81.4%（B1-3莖段I15處理的愈傷組織誘導率也是81.4%，但其很多愈傷僅在莖段兩端出現(xiàn)，誘導質量比I16處理差）。說明不同基因型及不同生長調節(jié)劑組合對萬壽菊母本資源愈傷組織的誘導效果存在明顯差異。愈傷組織轉至增殖培養(yǎng)基后，10～20 d為愈傷組織旺盛生長期，經2次繼代增殖后，愈傷組織表面呈顆粒狀，淺綠色或淺黃綠色，部分愈傷組織上夾雜綠色芽點（圖1-E和圖1-F）。

2. 3 NAA與6-BA組合對色素萬壽菊愈傷組織不定芽分化的影響

由表3可知，以同一母本資源色素萬壽菊的葉片和莖段為外植體，在NAA和6-BA組合處理下，葉片的愈傷組織不定芽分化率明顯高于莖段;4個母本資源葉片愈傷組織不定芽分化率排序總體上表現(xiàn)為B1-3>B1-1>Bnm>B1-4;當NAA濃度為0.5 mg/L時，4個母本資源葉片和莖段的愈傷組織不定芽分化率隨6-BA濃度的增加呈上升趨勢;在8個NAA和6-BA組合處理中，B1-3、B1-4和Bnm葉片和莖段愈傷組織的不定芽分化率均以D8組合最高，其中葉片的愈傷組織不定芽分化率分別為61.9%、51.9%和62.1%，莖段的愈傷組織不定芽分化率分別為52.6%、47.2%和47.4%，即在NAA和6-BA組合處理下，B1-3、Bnm和B1-4葉片和莖段愈傷組織不定芽分化的最佳培養(yǎng)基均為1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA;而B1-1的葉片愈傷組織不定芽分化率以D7組合最高，為58.2%，莖段愈傷組織不定芽分化率以D8組合最高，為51.6%，即在NAA和6-BA組合處理下，B1-1葉片愈傷組織不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，莖段愈傷組織不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA。說明不同基因型和不同生長調節(jié)劑組合對色素萬壽菊葉片和莖段的不定芽分化具有明顯影響。

2. 4 NAA與ZT組合對色素萬壽菊愈傷組織不定芽分化的影響

由表4可知，以同一母本資源色素萬壽菊的葉片和莖段為外植體，在NAA和ZT組合處理下，葉片的愈傷組織不定芽分化率明顯高于莖段;在相同NAA濃度處理下，其不定芽的分化率總體上隨ZT濃度的增加而升高;在8個NAA和ZT組合處理中，4個母本資源葉片和莖段的愈傷組織不定芽分化率均以T8組合最高，尤其以B1-3葉片和莖段的愈傷組織不定芽分化效果更突出，分化率分別達72.5%和57.7%;4個母本資源葉片和莖段的愈傷組織不定芽分化能力表現(xiàn)為B1-3>B1-1>Bnm>B1-4，即在NAA和ZT組合處理下，B1-1、B1-3、B1-4和Bnm葉片和莖段愈傷組織不定芽分化的最佳培養(yǎng)基均為1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L ZT。

從表2和表3還可看出，NAA與ZT組合處理4個色素萬壽菊母本資源的愈傷組織不定芽分化率均普遍高于NAA與6-BA組合。說明ZT與NAA組合對色素萬壽菊愈傷組織不定芽分化的促進作用大于NAA與6-BA組合。

2. 5 不定芽的生根培養(yǎng)

將4個色素萬壽菊的不定芽分別接種至1/2MS和MS培養(yǎng)基中，5～10 d后在芽的基部均能長出細根，其生根率見表5。觀察發(fā)現(xiàn)，在不添加任何激素的培養(yǎng)基中，色素萬壽菊根系生長相對緩慢，分支少，而在添加NAA的培養(yǎng)基中，色素萬壽菊發(fā)根較快，平均約5 d即長出根，且根相對粗壯，分支多。1/2MS培養(yǎng)基較MS培養(yǎng)基有利于色素萬壽菊生根培養(yǎng)，其中在1/2MS+0.1～0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中，B1-3和Bnm的生根效果較佳（圖1-G），生根率均為100.00%，B1-4的生根效果稍差，生根率分別為86.50%和90.10%（表5）。將生根后的色素萬壽菊完整植株經煉苗移栽至花盆中，遮陰、保濕培養(yǎng)30 d后幼苗移栽成活率在95.00%以上，經2～3個月的發(fā)育生長，獲得的再生植株全部為雄性不育材料（圖1-H）。

3 討論

植物組織培養(yǎng)中，植物基因型、外植體生理狀況、培養(yǎng)基、生長調節(jié)劑種類和組合及培養(yǎng)條件等均會影響培養(yǎng)效果。在萬壽菊組織培養(yǎng)研究中，多數研究者以幼嫩的營養(yǎng)器官如腋芽、含腋芽的莖段、葉片及無菌苗獲得的子葉和下胚軸為外植體，很少使用成熟植株的器官（付洪偉等，1999;孫嬋娟，2009;趙子剛等，2010;Pratibha and Datta，2001），而作為雜交母本的萬壽菊雄性不育系，只有等到現(xiàn)蕾后通過花序形態(tài)才能區(qū)分不育株與可育株，使其組培研究具有一定難度，但可通過不育株離體快繁有效保存母本資源（張華麗等，2011）。本研究中，采集色素萬壽菊現(xiàn)蕾后能分辨可育株與不育株的相對幼嫩葉片和莖段為外植體，比較兩種外植體的愈傷組織誘導、不定芽分化和生根效果，得出葉片對愈傷組織誘導速度及誘導率、不定芽分化率高于莖段的結論，與Vanegas等（2002）、齊迎春等（2005）、鄭杰等（2012）的研究結果一致。本研究中采用的色素萬壽菊葉片需經愈傷組織誘導途徑才能進一步分化不定芽，與林淦和周建平（2006）、趙子剛等（2010）利用萬壽菊葉片可直接產生不定芽的研究結果不一致，可能與所利用萬壽菊基因型存在差異、材料生理狀態(tài)不同和生長調劑組合不同有關。

生長調節(jié)劑是影響萬壽菊離體培養(yǎng)的關鍵因素，多數學者在萬壽菊的研究中采用6-BA與NAA組合（齊迎春等，2005;林淦和周建平，2006）或6-BA與IAA組合（Vanegas et al.，2002;趙子剛等，2010;張華麗等，2011）誘導不定芽獲得再生植株，本研究使用6-BA與NAA和ZT與NAA組合進行色素萬壽菊雄性不育株離體培養(yǎng)效果較佳，與付洪偉等（1999）對雜種大花萬壽菊側芽的研究結果相似。本研究結果表明，1/2MS+0.5 mg/L NAA有利于色素萬壽菊不定芽根系生長，與劉軍等（2004）的研究結果相似。

4 結論

葉片是誘導色素萬壽菊雄性不育系植株再生的良好材料，B1-3是獲得色素萬壽菊離體培養(yǎng)雄性不育植株最佳的母本資源;建立的色素萬壽菊雄性不育系離體快繁體系可為其育種研究和雜交種種子生產提供資源保障。

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（責任編輯 思利華）