鐵線蓮‘風之森林’葉綠素提取方法的比較研究

盛璐　孫夢嬌　張茜茹　余開船　楊茜茜　洪立強

摘要：研究不同的提取溶劑和提取方法對‘風之森林’葉綠素含量的影響.以鐵線蓮‘風之森林’為試驗材料，使用80%丙酮溶液、95%乙醇溶液、丙酮與無水乙醇（1：1）和丙酮：無水乙醇：水（4.5：4.5：1）這四種提取溶液，采用浸提法和研磨法分別處理，以期得出對于‘風之森林’來說葉綠素提取效果最佳的提取方法和提取劑.結(jié)果表明：當使用相同提取劑的不同提取方法時，浸提法提取效果最好;同種提取方法不同提取劑時，提取葉綠素效果最好的是丙酮與無水乙醇（1：1），其次丙酮：無水乙醇：水（4.5：4.5：1），再次95%乙醇溶液，最后為80%丙酮溶液.綜合比較分析‘風之森林’葉綠素以丙酮與無水乙醇（1：1）為提取劑，浸提法處理效果最佳.

關鍵詞：鐵線蓮‘風之森林’;葉綠素;提取溶劑

中圖分類號：S68;Q244;TS202.3? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2019）09-0040-04

鐵線蓮（Clematis L.）是毛茛科、鐵線蓮屬植物的總稱，多年生栽培植物，花色豐富，供園林觀賞的優(yōu)良品種.大多數(shù)該屬植物具有較高的藥用價值，是具有多重脅迫抗性的重要藥用植物[1].當前全國領域內(nèi)，鐵線蓮有多種分類方式，鐵線蓮苗圃相對常用的一種歸類法即“類群”歸類法.包括早花大花型、晚花大花型、長瓣型、大葉型、卷須型等[2].其中早花大花型為大花鐵線蓮中的早花品種，多在春夏季老枝上開花.常見品種：吉賽爾（Giselle）、愛莎（Asao）、蜜蜂之戀（Bees Jubilee）、魯佩爾博士（Doctor Ruppel）等[3].本實驗研究早花大花型中的風之森林（Sen-No-Kaze）品種，日本品種，育種家Tetsuya Hirota于2004年推出.當年生枝上開花，具有開花永遠重瓣、抗性強、花量大等特點，該品種喜充足陽光，適合花園種植，陽臺或露臺盆栽搭配深色背景看起來會更引人注目.當前我國對鐵線蓮屬植被的研究主要集中在品種資源調(diào)查、品種分類研究和栽培繁殖等方向[4]，并探討了鐵線蓮的園林應用方式和觀賞特性.關于國內(nèi)鐵線蓮優(yōu)良品種的光合作用、呼吸作用、礦質(zhì)營養(yǎng)、抗逆性等生理生態(tài)和國外優(yōu)秀品種方面的研究尚不充分，如對鐵線蓮日本品種‘風之森林’的研究方面幾乎是空白.在育種方面，‘風之森林’與國內(nèi)品種進行雜交育種很有可能培育出不同花色、不同花型或不同開花季節(jié)的新品種.而目前對其研究包括發(fā)育與代謝機理等幾乎空白.

葉綠素是高等植物和其他所有能進行光合作用的生物體含有的主要色素，直接參與光能的傳輸、分布和轉(zhuǎn)換等過程.其含量不僅體現(xiàn)植物的光合作用能力、發(fā)育變化過程、生長情況、生理代謝程度及營養(yǎng)要求，還可作為環(huán)境生理研究的重要參照標準[5].不同的葉綠素提取方法以及不同的提取溶劑具有明顯不同的提取效果.目前國內(nèi)外對葉綠素的化學性質(zhì)、提取分離方法、穩(wěn)定性影響因子及其他生理功能等方面展開了一定的研究.其中對葉綠素含量提取與測定一直是研究的重點[6].由當前的研究進展可知，葉綠素提取方法應用較為普遍的有研磨靜置法、單一溶劑和混合溶劑浸提法、冷凍浸提法等[7].提取溶液主要包括無水乙醇、純丙酮以及不同比例有機溶劑形成的混合溶液，且認為無水乙醇和丙酮混合溶劑是用于提取葉綠素的優(yōu)選提取劑.關于測定葉綠素含量的方法，主要使用紫外分光光度計、熒光分析、葉綠體儀等方法.已完成的相關實驗有大葉黃楊、油茶、棉花、玉米和一些果蔬的葉綠素含量測定，且都根據(jù)實驗得出了提取葉綠素較佳的方法和提取溶液.而關于‘風之森林’葉綠素提取與測定的研究未見報道，從而哪種提取方法更好更沒有相應的參考依據(jù).本次試驗則通過采用四種提取溶劑和兩種提取方法對‘風之森林’葉綠素含量測定進行研究，旨在找出最佳的提取方法，為‘風之森林’葉綠素含量提取方法的選擇提供依據(jù)，準確地測定葉綠素含量以期為其生長發(fā)育以及逆境脅迫等實驗提供基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵線蓮‘風之森林’葉片、無水乙醇、純丙酮、碳酸鈣.

1.2 儀器與設備

752型紫外分光光度計、石英比色皿、萬分之一電子分析天平、剪刀、研缽、容量瓶、試管.

1.3 試驗處理

先按照體積比配置一定量提取溶液待用，即80%丙酮溶液、95%乙醇溶液、丙酮與無水乙醇（1：1）和丙酮：無水乙醇：水（4.5：4.5：1）.丙酮處理時需注意實驗室通風，戴口罩，不使用時保持緊密并避免受損.

1.4 試驗方法

1.4.1 研磨法

以提取溶液80%丙酮為例，在鐵線蓮‘風之森林’植株上選擇生長發(fā)育情況良好、無病蟲害的葉片，洗凈，濾紙吸干，剪去大葉脈，其余葉片剪碎.使用天平精準稱取0.2g葉片放入研缽中，然后加入80%丙酮2-3ml及少量碳酸鈣進行研磨，磨成勻漿后，將其濾到25ml容量瓶中，然后用相應提取液把研缽、濾紙和雜質(zhì)清洗至白色，將洗滌液濾到容量瓶中，最后用80%丙酮定容到25ml，上下倒置充分混合均勻.將葉綠素提取液倒入石英比色皿中，以對應提取劑為比較組，在紫外分光光度計下測波長645nm和663nm下的吸光度，根據(jù)Arnon法把葉綠素a和葉綠素b的含量計算出來.

用95%乙醇溶液、丙酮與無水乙醇（1：1）和丙酮：無水乙醇：水（4.5：4.5：1）提取液作對比試驗，每種提取液都要重復三次試驗.

1.4.2 浸提法

以提取液80%丙酮為例，葉片前期處理如研磨法，精準稱取0.2g葉片，快速放于10ml試管中，加入少量碳酸鈣和10ml提取液，并置于培養(yǎng)箱中黑暗浸泡24h，注意不時搖晃.24h后，取出待測鐵線蓮，將試管中綠色液體倒入25ml容量瓶中，最后用80%丙酮定容到25ml，充分混合均勻.后續(xù)處理與研磨法相同，即使用比色皿在分光光度計上測量相應波長下的吸光度值，使用公式計算葉綠素a和葉綠素b的含量.

1.5 數(shù)據(jù)處理

葉綠素含量的計算：

C=（12.71Α-2.59?。￢∕（1000m）? （1-1）

C=（22.88Α-4.67Α）V∕（1000m）? （1-2）

C=C+C? ? （1-3）

式中葉綠素含量的單位為mg/g，A和A分別為663nm和645nm下的吸光度值，V為提取溶劑體積即25ml，W為所取‘風之森林’葉片質(zhì)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 研磨法提取葉綠素

四種提取溶液對葉綠素提取效果的比較.試驗結(jié)果見表1-1、表1-2、表1-3.從表中數(shù)據(jù)可以看出在室溫條件下不同提取溶液對葉綠素提取效果不同.其中三次重復試驗均表明研磨法提取效果最好的提取劑為丙酮與無水乙醇（1：1），葉綠素a的含量分別為1.333、1.220、1.253mg/g，葉綠素b的含量分別為0.545、0.455、0.472mg/g，總?cè)~綠素含量分別為1.878、1.675、1.725mg/g.其次為丙酮：無水乙醇：水（4.5：4.5：1），再次是95%乙醇溶液，葉綠素提取含量最低的提取劑是80%丙酮溶液，葉綠素a的含量分別為0.818、0.914、0.861mg/g，葉綠素b的含量分別為0.260、0.324、0.320mg/g，總?cè)~綠素含量分別為1.078、1.238、1.181mg/g.每種提取溶液的三次重復試驗中，葉綠素含量有些許差別，可能與每次試驗過程前葉片的選擇和處理以及研磨過程中的研磨不完全有關，也可能與三次處理在空氣中暴露時間不同有關.且三次試驗處理時間不同，都有可能影響葉綠素含量.但四種提取劑的三次試驗中，關于葉綠素研磨法提取效果由高到低的結(jié)果最終是相同的.

在前人研究的基礎上，了解到碳酸鈣具有減弱葉綠素分解的作用[8]，原因可能是在進行試驗操作前，需把‘風之森林’葉片剪碎，而這會損害葉片結(jié)構(gòu)，其細胞結(jié)構(gòu)受到破壞會影響葉綠體中的色素，對色素所處環(huán)境產(chǎn)生一定的影響，這就導致葉綠素的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，受到損害.碳酸鈣能夠保護微堿性的色素，減少葉綠素的損失，因此在兩種方法中均加入了碳酸鈣.

2.2 浸提法提取葉綠素

四種提取溶液對葉綠素提取效果的比較.使用浸提法不同提取溶液對‘風之森林’葉綠素提取的影響結(jié)果見表2-1、2-2和2-3.

由表可知，三次重復試驗均表明浸提法提取效果最佳的提取溶液為丙酮與無水乙醇（1：1），由高到低依次為丙酮：無水乙醇：水（4.5：4.5：1）、95%乙醇溶液、80%丙酮溶液.結(jié)果也表明丙酮與無水乙醇（1：1）和丙酮：無水乙醇：水（4.5：4.5：1）這兩種提取效果高于80%丙酮溶液和95%乙醇溶液.這也與其他相關葉綠素含量測定試驗的結(jié)果相同，證實了浸提法提取葉綠素中混合溶液比單一溶液好，并了解到這可能是一種協(xié)同萃取作用，存在乙醇與丙酮之間，這種作用可以使葉綠素提取速度加快，從而高于單一溶液.在單一溶劑中，95%乙醇溶液提取效果又比80%丙酮溶液好，說明80%丙酮在提取葉綠素方面不充分，這是因為丙酮容易揮發(fā)，提取溶液少而影響葉綠素的提取.這與其他對柿樹、玉米和菠菜等關于葉綠素含量的試驗結(jié)果一致.而在查閱相關文獻中，這一結(jié)果又與古川照雄用無水乙醇提取葉綠素的研究有一定的差別，他的研究則表明乙醇提取葉綠素不完全.張憲政也指出此種方法充分提取葉綠素所需時間長，對某些植物來說可能提取不夠充分，精確度不高，所以這種方法的應用也不普遍[9].

2.3 兩種提取方法的比較結(jié)果

首先從總體上看研磨法和浸提法關于提取葉綠素效果最佳的提取劑都為丙酮與無水乙醇（1：1），且提取劑提取葉綠素含量由高到低都依次為丙酮：無水乙醇：水（4.5：4.5：1）、95%乙醇溶液、80%丙酮溶液.

由上面六個表可知，浸提法提取葉綠素a的含量、葉綠素b的含量和總?cè)~綠素含量都顯著高于研磨法.使用研磨法，這四種提取劑所提取的葉綠素含量都顯著低于浸提法，大概是因為在研磨過程中對‘風之森林’葉片研磨不徹底，研磨時間比較短，提取葉片葉綠素時間也相對短，葉綠素提取不完全且研磨時也會加快葉綠素的分解速度，這就會導致提取的葉綠素含量少.研磨時也可能會因為破壞了葉綠素的結(jié)構(gòu)使提取后的葉綠素不穩(wěn)定，見光時易分解[10].在對葉片研磨完成后的研缽、濾紙和雜質(zhì)用提取劑清洗時，可能會因為未清洗干凈而使葉綠素含量減少.浸提法操作簡單方便，處理過程中葉片葉綠素相對提取完全，在黑暗中放置也會減少葉綠素的損失.這也與劉遵春等[11]的研究結(jié)果一致，都表現(xiàn)出提取葉綠素含量時浸提法優(yōu)于研磨法.浸提法更適合于快速精確地提取‘風之森林’葉片葉綠素.

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，無論是使用研磨法還是浸提法，提取葉綠素效果最佳的選擇都是丙酮與乙醇（1：1）.然后比較兩種方法，研磨法步驟較多，工作量大，效率低速度慢，研磨過程會造成葉綠素的大量損失.而浸提法操作簡單，效率高速度快，浸提過程中葉綠素損失少，提取相對完全，對于進行大批量葉片葉綠素含量測定具有重要實際意義.且由上述試驗數(shù)據(jù)可知浸提法優(yōu)于研磨法.因此，利用浸提法，采用丙酮與無水乙醇（1：1）提取液提取‘風之森林’葉片葉綠素為最佳方法.

關于葉綠素提取方法一直是研究的重點，不同研究植物所采用測定葉綠素含量的方法不同，同一研究植物葉片不同階段、不同位置葉綠素含量也有所差別.而本次試驗中采取‘風之森林’植物葉片，通過各種提取溶液提取，進行一系列操作來測定葉綠素含量，可能會有一定的誤差[6].本次試驗測定葉綠素采用了紫外分光光度計，但并不僅局限于這一種方法，目前還經(jīng)常使用的是葉綠體儀.它小巧方便攜帶，可隨時快速測定葉綠素含量，所測葉片受損程度小.王元軍在對黑豆芽苗菜葉綠素提取方法進行研究時，還采用了冷凍浸提法，且他的研究結(jié)果已表明冷凍浸提法比浸提法和研磨法的效果好.這是因為冷凍過程會使細胞破碎，提取葉綠素過程速度比較快，減少了葉綠素損失，提取完全[12].程貴文等[13]對油茶葉綠素含量測定方法進行比較研究時，提取溶液中還加入了丙酮與無水乙醇（2：1），且得到的試驗結(jié)果表明丙酮與無水乙醇（2：1）是最佳的提取方法.徐芬芬等[14]不僅探討了不同提取方法下小白菜葉片葉綠素含量的提取效果比較，對其葉綠素在不同有機溶劑中的穩(wěn)定性也展開研究.劉秀麗等人[15]還對影響葉綠素含量測定的因素如溫度、光照等進行了一系列分析.可見對于‘風之森林’葉片葉綠素提取方法還有待進一步研究.

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