降糖活性物6—芐氧基—9——4—氯甲苯?；臍浠沁颉?—羧酸在人工胃腸液中的穩(wěn)定性研究及降解產(chǎn)物分析

張吉泉 郝陽 陳瑞 王麗麗 湯磊

摘 要 目的：考察降糖活性物6-芐氧基-9-（-4-氯甲苯?；?四氫化咔唑-3-羧酸（簡(jiǎn)稱“Zg02”）在人工胃腸液中的穩(wěn)定性，并分析其降解產(chǎn)物。方法：采用高效液相色譜法，以吲哚美辛為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)Zg02在空白人工胃液（pH 1.3，不含酶）、空白人工腸液（pH 6.8，不含酶）、人工胃液（pH 1.3，含胃蛋白酶）和人工腸液（pH 6.8，含胰蛋白酶）中孵育6 h的含量變化，計(jì)算Zg02剩余百分比；利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)分析對(duì)照樣品（Zg02對(duì)照品溶液）、空白樣品（未加入Zg02的孵育溶液）、孵育樣品（穩(wěn)定性試驗(yàn)中Zg02濃度變化最明顯的孵育體系）的總離子流圖，比較差異峰，通過MS圖推測(cè)降解產(chǎn)物。結(jié)果：Zg02在空白人工腸液和人工腸液中孵育不同時(shí)間的剩余百分比均在90%～110%范圍內(nèi)；Zg02在酸性（pH 1.3）條件中不穩(wěn)定，在孵育3 h時(shí)剩余百分比約為50%，繼續(xù)孵育剩余百分比無明顯變化，人工胃液（含酶）中的剩余百分比低于空白人工胃液（不含酶）的剩余百分比，但相差不明顯。孵育樣品與對(duì)照樣品、空白樣品的差異體現(xiàn)在負(fù)模式掃描下保留時(shí)間為5.23 min時(shí)，該時(shí)間點(diǎn)色譜峰的MS顯示，低能量掃描通道存在m/z 320.127 2[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，高能量通道可見碎片離子峰230.081 5、276.138 2，推測(cè)Zg02在酸性（pH 1.3）條件下可能發(fā)生酰胺鍵斷裂生成6-芐氧基-四氫化咔唑-3-羧酸。結(jié)論：Zg02在人工腸液中穩(wěn)定性良好；在酸性（pH 1.3）條件下不穩(wěn)定，基本上不受胃蛋白酶的影響，降解產(chǎn)物可能為6-芐氧基-四氫化咔唑-3-羧酸。

關(guān)鍵詞 降糖活性物；6-芐氧基-9-（-4-氯甲苯酰基）-四氫化咔唑-3-羧酸；人工胃腸液；穩(wěn)定性；降解產(chǎn)物

Study on the Stability of Hypoglycemic Candidate 6-benzyloxy-9-（-4-chlorobenzoyl）-tetrahydrocarbazole- 3-carboxylic Acid in Artificial Gastrointestinal Fluid and Catabolites Analysis

ZHANG Jiquan1，2，HAO Yang3，CHEN Rui2，WANG Lili2，TANG Lei2（1.College of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；2.Guizhou Medical University/Guizhou Provincial Engineering Technology Research Center for Chemical Drug R&D， Guiyang 550004， China；3.Dept. of Pharmacy， Guiyang Maternal and Child Health-care Hospital， Guiyang 550003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the stability of hypoglycemic candidate 6-benzyloxy-9-（-4-chlorobenzoyl）- tetrahydrocarbazole-3-carboxylic acid （abbreviated “Zg02”） in artificial gastrointestinal fluid， and to analyze its catabolites. METHODS： Using indometacin as internal standard， HPLC method was used to detect the contents of Zg02 incubated in blank artificial gastric fluid （pH 1.3，no enzyme）， blank artificial intestinal fluid （pH 6.8， no enzyme）， artificial gastric fluid （pH 1.3， containing pepsin） and artificial intestinal fluid （pH 6.8， containing trypsin） for 6 h. The remaining percentage was calculated. UPLC-Q-TOF was used to analyze TIC of control sample （Zg02 control solution）， blank sample （incubation solution without Zg02） and incubated sample （incubation system with the most obvious change of Zg02 concentration in stability test）； difference peaks were compared， and catabolites were inferred by MS map. RESULTS： The remaining percentage of Zg02 incubated in blank artificial intestinal fluid and artificial intestinal fluid for different time ranged 90%-110%. Zg02 was unstable in acidic condition （pH 1.3）. The remaining percentage was about 50% after incubated for 3 h. There was no significant change in the remaining percentage of continuous incubation. The remaining percentage of artificial gastric fluid （including enzymes） was lower than that of blank artificial gastric fluid （without enzymes）， but the difference was not obvious. The difference of incubated samples， control samples and blank samples was reflected that the retention time was 5.23 min under negative mode scanning， MS of chromatographic peaks at this time point showed that quasi-molecular ion peaks of m/z 320.127 2 [M-H]- existed in low energy scanning channels and fragment ion peaks of 230.081 5 and 276.138 2 could be seen in high energy channels. It was speculated that amide bond breakage may occur in Zg02 under acidic （pH 1.3） conditions to generate 6-benzyloxy-tetrahydrocarbazole-3-carboxylic acid. CONCLUSIONS： Zg02 is stable in artificial intestinal fluid； Zg02 is not stable in acidic condition （pH 1.3）， and is basically not affected by pepsin， the degradation products may be 6-（benzyloxy）-tetrahydrocarbazole-3-carboxylic acid.

KEYWORDS Hypoglycemic candidate； 6-benzyloxy-9-（-4-chlorobenzoyl） -tetrahydrocarbazole-3-carboxylic acid； Artificial gastrointestinal fluid； Stability； Catabolite

糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗而引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂性疾病。目前，抗糖尿病藥物的研發(fā)已經(jīng)成為創(chuàng)新藥物研究的重要方向[1-2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一系列四氫咔唑類化合物有明顯的降糖作用，其中優(yōu)選性化合物為6-芐氧基-9-（-4-氯甲苯酰基）-四氫化咔唑-3-羧酸（簡(jiǎn)稱“Zg02”）[3]。Zg02具有較好的體內(nèi)外降糖活性，可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途徑降低 2型糖尿病db/db小鼠的血糖和胰島素水平[4]。Zg02是一個(gè)值得深入開發(fā)研究的候選化合物，本課題組前期已完成了對(duì)其合成工藝路線優(yōu)化以克服收率低、純化難等問題[5-6]，為接下來的成藥性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

藥物在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性試驗(yàn)是藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程中非常必要的研究步驟，特別是口服藥物在胃腸道的穩(wěn)定性，將會(huì)直接影響到藥物在胃腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)的有效性[7]。所以，研究Zg02在人工胃腸液中的穩(wěn)定性對(duì)評(píng)價(jià)其成藥性及該類化合物的體內(nèi)代謝行為具有重要意義。本研究通過高效液相色譜（HPLC）法，以吲哚美辛為內(nèi)標(biāo)，考察Zg02在空白人工胃腸液（未加胃蛋白酶及胰蛋白酶）及人工胃腸液中的穩(wěn)定性[8]，為其吸收機(jī)制與新劑型的開發(fā)提供參考。此外還利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)，比較了空白樣品、對(duì)照樣品和體外孵育樣品三者的圖譜差異，分析Zg02可能的降解產(chǎn)物，指出其結(jié)構(gòu)代謝不穩(wěn)定位點(diǎn)，從而闡明Zg02可能的體內(nèi)代謝行為，為其后續(xù)結(jié)構(gòu)改造與優(yōu)化提供理論參考。Zg02和吲哚美辛的結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS型UPLC-Q-TOF/MS儀（包括MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站、UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)）和e2695型HPLC儀（美國(guó)Waters公司）；XH-B型漩渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；JN300-2型氮?dú)獯祾邇x（蘇州吉米諾儀器有限公司）；KH-600E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；FA805N型十萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

Zg02原料藥（貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào)：2018052201，純度：>98%）；吲哚美辛對(duì)照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：J0526A5，純度：>98%）；肝素鈉（批號(hào)：325D025）、胰蛋白酶（批號(hào)：513H041，酶活性：3 000～3 500 U/g）、胃蛋白酶（批號(hào)：1104C034，酶活性：250 U/mg）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；甲酸（德國(guó)CNW公司，批號(hào)：X075K150，HPLC級(jí)）；甲醇、乙腈（德國(guó)默克股份兩合公司，色譜純）；水為超純水。

2 方法

2.1 Zg02含量測(cè)定的色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.5 mm，5 μm）；保護(hù)柱：Waters Symmetry C18（VanGuard Cartidge，3.9 mm×5 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水（75 ∶ 25，V/V）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 降解產(chǎn)物定性檢測(cè)的UPLC-Q-TOF/MS條件

色譜柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.01%甲酸水（A）-0.01%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序：0～2 min，95%A；2～15 min，95%→2%A；15～17 min，2%A；17～20 min，2%→95%A）；流速：0.40 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；進(jìn)樣時(shí)間：20 min。電噴霧電離源（ESI）；負(fù)離子模式采集（Negative mode），毛細(xì)管電壓：1.5 kV；離子源溫度：120 ℃，溶劑氣溫度：400 ℃，脫溶劑氣流量：800 L/h，錐孔氣流量：50 L/h；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件MassLynx V 4.1工作站，掃描方式MSE Continuum模式，掃描范圍質(zhì)荷比（m/z）：50～1 200。

2.3 溶液的制備

精密稱取 Zg02原料藥適量，以甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，制備成質(zhì)量濃度為10 mmol/L的Zg02對(duì)照品貯備液；同樣精密稱取吲哚美辛對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，制備成濃度為5 mmol/L的內(nèi)標(biāo)貯備液，4 ℃貯藏。使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。

2.4 Zg02的含量測(cè)定

2.4.1 樣品處理方法 取200 μL待處理溶液，加入濃度為14.01 μmol/L的內(nèi)標(biāo)溶液400 μL，于4 ℃下按20 000×g高速離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量為20 μL。

2.4.2 空白基質(zhì)溶液的制備 取0.1 g胰蛋白酶加10 mL水于50 mL燒杯中，搖勻使其充分溶解后，加熱至煮沸10 min，得到滅活的胰蛋白酶溶液。取0.1 g胃蛋白酶加10 mL水于50 mL燒杯中，搖勻使其充分溶解后，加熱至煮沸10 min，得到滅活的胃蛋白酶溶液。將兩液混合后，加34 mg磷酸二氫鉀，溶解后加水定容至25 mL量瓶中，即為空白基質(zhì)溶液。

2.4.3 專屬性考察 取空白基質(zhì)溶液200 μL加400 μL甲醇渦旋混勻1 min，4 ℃下以20 000×g離心10 min，取上清液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。將一定濃度的Zg02對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入至空白基質(zhì)（含甲醇量1%）中，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法處理后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取空白基質(zhì)溶液198 μL，分別精密移取不同濃度的Zg02對(duì)照品溶液2 μL，制成Zg02濃度依次為1.09、2.18、4.36、10.89、21.78、43.56 μmol/L的樣品溶液（含甲醇量1%），按照“2.4.1”項(xiàng)下方法處理后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。以Zg02峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），Zg02的濃度為橫坐標(biāo)（x），進(jìn)行回歸分析。

2.4.5 準(zhǔn)確度、精密度及樣品穩(wěn)定性考察 取空白基質(zhì)198 μL，分別精密加入不同濃度的Zg02對(duì)照品溶液2 μL，制備成低、中、高濃度（2.18、10.89、21.78 μmol/L）的質(zhì)控樣品溶液，每一濃度平行5份，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法處理后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算Zg02含量。以測(cè)得值與真實(shí)值的比值計(jì)算回收率考察準(zhǔn)確度，以含量的RSD考察精密度。上述樣品溶液處理后，室溫放置12 h，再進(jìn)樣檢測(cè)，考察穩(wěn)定性。

2.5 Zg02在人工胃腸液中穩(wěn)定性考察

2.5.1 人工胃液的制備 按文獻(xiàn)[9]中方法，取16. 4 mL稀鹽酸，加800 mL 水與10 g胃蛋白酶，搖勻使其充分溶解后，調(diào)節(jié) pH至1.3，加水稀釋定容至1 000 mL量瓶中，即為人工胃液。

2.5.2 人工腸液的制備 按文獻(xiàn)[9]中方法，取6.8 g磷酸二氫鉀，加500 mL水使其溶解，0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH至6.8；另稱取10 g胰蛋白酶加適量水溶解，將兩液混合后，加水稀釋定容至 1 000 mL量瓶中，即為人工腸液。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密取50 μL濃度為的1.09 mmol/L的Zg02對(duì)照品溶液于5 mL EP管中，分成4組，分別加入空白人工胃液（未加胃蛋白酶）、空白人工腸液（未加胰蛋白酶）、人工胃液、人工腸液稀釋至刻度使含醇量均為1%，分別用EP管分裝200 μL，置于37 ℃水浴中孵育，分別于 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 h加入400 μL濃度為14.01 μmol/L的內(nèi)標(biāo)溶液，終止反應(yīng)，于4 ℃下20 000×g高速離心10 min，取上清液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，試驗(yàn)平行重復(fù)3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算相應(yīng)的藥物濃度。

2.6 Zg02的降解產(chǎn)物檢測(cè)試驗(yàn)

采集在“2.5.3”項(xiàng)下穩(wěn)定性試驗(yàn)中Zg02濃度有明顯變化的孵育體系為體外孵育樣品，并以Zg02對(duì)照品溶液為對(duì)照樣品、未加入Zg02的孵育溶液（人工胃液、人工腸液）為空白樣品，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，比較空白樣品、對(duì)照樣品和體外孵育樣品三者的總離子流圖，找出差異峰。并根據(jù)MSE Continuum模式，得到各色譜峰的準(zhǔn)分子離子及碎片離子信息，分析差異峰中的準(zhǔn)分子離子峰與碎片離子峰，推測(cè)Zg02的降解產(chǎn)物。

3 結(jié)果

3.1 Zg02含量測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專屬性 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，Zg02和內(nèi)標(biāo)（吲哚美辛）能同時(shí)被檢測(cè)到，保留時(shí)間分別為8.84、6.24 min，分離度良好，不受其他雜質(zhì)干擾，色譜圖見圖2。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 Zg02標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y= 0.132 8x-0.032 8（R2=0.999 3，n=6），結(jié)果表明，Zg02檢測(cè)濃度的線性范圍為1.09～43.56 μmol/L，定量下限為2.18 μmol/L。

3.1.3 準(zhǔn)確度、精密度及樣品穩(wěn)定性 Zg02在低、中、高濃度（2.18、10.89、21.78 μmol/L）樣品溶液中的準(zhǔn)確度為（86.66±4.28）%～（94.88±6.79）%（n=5），精密度試驗(yàn)中含量的RSD均小于10%（n=5），穩(wěn)定性試驗(yàn)中12 h內(nèi)的RSD均小于10%（n=5），均符合相關(guān)要求，具體結(jié)果見表1。

3.2 Zg02在人工胃腸液中的穩(wěn)定性

以孵育0時(shí)Zg02的理論濃度10.89 μmol/L設(shè)為剩余百分比100%，將各孵育時(shí)間點(diǎn)的濃度轉(zhuǎn)換為剩余百分比，結(jié)果見表2。

由表2顯示，Zg02在空白人工腸液和人工腸液中孵育不同時(shí)間的剩余百分比均在90%～110%范圍內(nèi)；Zg02在酸性（pH 1.3）條件中不穩(wěn)定，在孵育3 h時(shí)剩余百分比約為50%，繼續(xù)孵育剩余百分比無明顯變化，推測(cè)降解反應(yīng)達(dá)到平衡。

3.3 Zg02降解產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照樣品、空白樣品及體外孵育樣品的總離子流圖見圖3。

對(duì)比圖3中圖譜發(fā)現(xiàn)，體外孵育樣品與對(duì)照樣品、空白樣品的差異體現(xiàn)在負(fù)模式掃描下保留時(shí)間5.23 min時(shí)。針對(duì)5.23 min的MS圖顯示，低能量掃描通道存在m/z 320.127 2[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，高能量通道可見碎片離子峰230.081 5、276.138 2，降解產(chǎn)物的MS圖見圖4。

4 討論

Zg02在人工胃腸液中穩(wěn)定性的孵育時(shí)間選定在6 h內(nèi)是考慮到大多數(shù)藥物在胃腸的停留時(shí)間不超過6 h。

分析方法驗(yàn)證的目的與意義在于考察Zg02、內(nèi)標(biāo)與所含基質(zhì)組分是否能有效分離以及在所建立的檢測(cè)方法里是否準(zhǔn)確定量。因此，需考察孵育體系中存在的緩沖液、各種酶是否能與待測(cè)樣品有效分離。考慮到pH與酶是影響檢測(cè)物質(zhì)是否穩(wěn)定的因素，所以配制空白基質(zhì)時(shí)選用了已高溫滅活的胃蛋白酶、胰蛋白酶。

胃腸液穩(wěn)定性結(jié)果顯示，Zg02在人工腸液中穩(wěn)定性良好；Zg02在人工胃液（含酶）中的剩余百分比低于空白人工胃液（不含酶）的剩余百分比，但差異不明顯，在系統(tǒng)測(cè)量誤差范圍內(nèi)。故在描述時(shí)只能斷定Zg02在酸性（pH 1.3）條件下不穩(wěn)定，基本上不受胃蛋白酶的影響。

在藥物的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)過程中，候選藥物經(jīng)常要被暴露于很多種溶液中，如有機(jī)溶劑貯備液、緩沖水溶液、生物學(xué)測(cè)定緩沖液、給藥溶液以及胃腸道液體。因此，化合物在溶液中具有較好的穩(wěn)定性是必要的。本研究主要考察受試化合物在胃腸道中的穩(wěn)定性，了解候選化合物的代謝穩(wěn)定性，為后續(xù)研究與開發(fā)提供重要參考。

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（收稿日期：2019-01-19 修回日期：2019-03-19）

（編輯：鄒麗娟）