阿德福韋衍生物灌胃給藥后的代謝產(chǎn)物阿德福韋在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

肖濤 楊洋 李韜 李靜 傅曉鐘 吳帝容 王洋 肖紅

摘 要 目的：建立阿德福韋（PMEA）的含量測(cè)定方法，并研究阿德福韋衍生物[阿德福韋前藥，阿德福韋-熊去氧膽酸-3-丙基酯，L-亮氨酸-3-丙基酯（PMEA-1c）]灌胃給藥后的代謝產(chǎn)物PMEA在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)。方法：采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC- MS/MS）法。色譜柱為BEH C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水（梯度洗脫），流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL；檢測(cè)離子對(duì)為PMEA質(zhì)荷比（m/z）274.1→162.1，葛根素（內(nèi)標(biāo)）m/z 417.1→267.1。12只大鼠隨機(jī)分為阿德福韋酯（ADV）組（陽性對(duì)照，90 mg/kg）、PMEA-1c組（160 mg/kg），每組6只，分別灌胃給予相應(yīng)藥物1次，于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h尾靜脈取血測(cè)定PMEA血藥濃度；利用DAS 2.0軟件計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：PMEA檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為6.1～440.0 ng/mL（r=0.998 5），日內(nèi)、日間精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均<10%（n=3、5、6），準(zhǔn)確度為82.16%～97.33%（RSD≤6.4%， n=5），基質(zhì)效應(yīng)為95.96%～106.35%（RSD≤4.9%， n=5）；ADV組和PMEA-1c組大鼠血漿中PMEA的t1/2分別為（1.762±0.117）、（2.548±0.174） h，AUC0-24 h分別為（2 170.059±146.091）、（4 704.257±176.792） μg·h/L，cmax分別為（613.092±9.504）、（697.295±15.275） μg /L；與ADV組比較，PMEA-1c組大鼠t1/2、AUC0-24 h、AUC0-∞、cmax均顯著增加（P<0.01或P<0.001）。結(jié)論：建立的方法準(zhǔn)確可靠，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PMEA-1c代謝為單室模型，其可作為阿德福韋前藥的潛力藥物，為阿德福韋前藥的繼續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 阿德福韋；阿德福韋衍生物；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；藥動(dòng)學(xué)

Study on Pharmacokinetics of Metabolites of Adefovir in Rats after Intragastric Administration of Adefovir Derivatives

XIAO Tao1，2，YANG Yang1，2，LI Tao1，2，LI Jing1，2，F(xiàn)U Xiaozhong2，WU Dirong2，WANG Yang2，XIAO Hong2（1.Key Lab of Pharmaceutics of Guizhou Provience， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；2.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM， School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of adefovir （PMEA） and study the pharmacokinetics of metabolites PMEA in rats after intragastric administration of PMEA derivatives [PMEA prodrug， adefovir-ursodeoxycholic acid-3-propyl ester， L-leucine-3-propyl ester （PMEA-1c）] in rats. METHODS： HPLC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid acetonitrile-0.1% formic acid water （gradient elution） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 1 μL. The quantitative ions were PMEA m/z 274.1→162.1， puerarin （internal standard） m/z 417.1→267.1. 12 rats were randomly divided into adefovir dipivoxil （ADV） group （positive control， 90 mg/kg） and PMEA-1c group （160 mg/kg）， with 6 rats in each group. They were given relevant medicine once intragstrically， and the blood samples were collected from tail vein 0.083， 0.25， 0.5， 0.75， 1， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 24 h after administration to determine the plasma concentration of PMEA. Relevant pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 2.0 software. RESULTS： The linear range of PMEA was 6.1-440.0 ng/mL （r=0.998 5）. RSDs of intra and inter day of precision and stability tests were all less than 10% （n=3， 5， 6）， and the accuracy was 82.16%-97.33% （RSD≤6.4%， n=5）. Matrix effects ranged from 95.96%-106.35% （RSD≤4.9%， n=5）. The pharmacokinetic parameters of PMEA in ADV group and PMEA-1c group were as follows as t1/2 were （1.762±0.117） and （2.548±0.174） h； AUC0-24 h were （2 170.059±146.091） and （4 704.257±176.792） μg·h/L； cmax were （613.092±9.504） and （697.295±15.275） μg/L， respectively. Compared with ADV group， t1/2， AUC0-24 h， AUC0-∞ and cmax of rats in PMEA-1c group were increased significantly （P<0.01 or P<0.001）. CONCLUSIONS： Established method is accurate and reliable. The trial indicates that PMEA-1c metabolism is single compartment model， show that can be used as a potential prodrug for adefovir， which lay a foundation for the further study of adefovir prodrug.

KEYWORDS Adefovir；Adefovir derivative； HPLC-MS/MS； Pharmacokinetics

阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，ADV）是美國(guó)FDA在2002年批準(zhǔn)上市的由Gilead Science公司研制的第一個(gè)非環(huán)核苷膦酸酯類抗乙型肝炎病毒（HBV）藥物，是阿德福韋（PMEA）的親脂性口服前藥，口服后在非特異性酯酶水解作用下迅速轉(zhuǎn)化為活性PMEA而發(fā)揮藥效，ADV具有較好的抗HBV活性，并且對(duì)拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋、泛昔洛韋以及恩曲他濱等核苷類似物產(chǎn)生耐藥的變異HBV也能產(chǎn)生較好的抑制效果[1-5]，但是ADV在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其存在劑量依賴性和腎毒性，引起腎性糖尿及蛋白尿等[6-7]。

為了尋找更優(yōu)的PMEA前藥，貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)課題組前期通過在PMEA結(jié)構(gòu)中引入L-氨基酸和膽酸結(jié)構(gòu)合成了一系列PMEA單L-氨基酸酯及單膽酸酯衍生物，利用內(nèi)源性的膽汁酸和L-氨基酸增加主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)提高藥物吸收，實(shí)現(xiàn)藥物的肝靶向富集，提高抗病毒活性，同時(shí)降低PMEA前藥的毒副作用[8-9]?？共《净钚匝芯亢驮渭?xì)胞攝取研究結(jié)果表明[10]，PMEA單L-氨基酸酯及單膽酸酯衍生物對(duì)HBV-DNA復(fù)制的抑制效果和大鼠原代肝細(xì)胞攝取能力顯著提高，其中阿德福韋-熊去氧膽酸-3-丙基酯，L-亮氨酸-3-丙基酯（PMEA- 1c）的抗病毒活性較強(qiáng)。因此，筆者在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)PMEA-1c在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，以期為PMEA衍生物的后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。PMEA-1c結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 材料

1.1 儀器

QTRAP-5500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；Allegra 64R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司）；AE240萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；HT-8000高純氮?dú)鈾C(jī)（上海奧突斯工貿(mào)有限公司）

1.2 藥品與試劑

PMEA-1c（貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院傅曉鐘課題組合成，批號(hào)：201804，純度：≥98%）；PMEA對(duì)照品（批號(hào)：FG260083，純度：≥98%）、阿德福韋酯對(duì)照品（批號(hào)：CC310105，純度：≥98%）均購自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；葛根素對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0752-9605，純度：≥98%），甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠，♂，體質(zhì)量180～220 g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（黔）2018-0001。動(dòng)物于（22±2） ℃飼養(yǎng)，飼養(yǎng)管理均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求及規(guī)則，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)為1801220，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 PMEA血藥濃度測(cè)定

2.1.1 色譜與質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：BEH C18（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～1 min，5%A；1～7 min，5%→95%A；7～8 min，95%A，8～9 min，95%→5%A ）；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

（2）質(zhì)譜條件。采用電噴霧電離源（ESI），檢測(cè)方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），掃描模式為正離子模式；PMEA檢測(cè)離子對(duì)質(zhì)荷比（m/z）為274.1→162.1，碰撞電壓為35 V；葛根素m/z 為417.1→267.1，碰撞電壓為46 V；毛細(xì)管電離電壓為5 500 V，去溶劑溫度為550 ℃，氣體流速為9 L/min，氣體壓強(qiáng)為40 psi。

2.1.2 溶液的制備

（1）PMEA對(duì)照品溶液的制備。精密稱定2.26 mg PMEA對(duì)照品于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容，混勻，得質(zhì)量濃度為226.00 μg/mL的PMEA對(duì)照品貯備液。取390 μL貯備液于2 mL量瓶，甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為44 μg/mL的PMEA對(duì)照品溶液。

（2）葛根素溶液的制備。精密稱定2.5 mg葛根素對(duì)照品于25 mL量瓶，甲醇溶解定容，混勻，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葛根素貯備液。取適量貯備液于量瓶，甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為10.00 ng/mL葛根素溶液。

2.1.3 血漿樣品的處理方法

取血漿樣品100 μL于1.5 mL離心管中，加入400 μL含內(nèi)標(biāo)甲醇溶液，渦旋1 min，超聲（功率：250 W，頻率：80 kHz，下同）5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液用氮?dú)獯蹈伞?00 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋1 min，超聲5 min，10 000 r/min離心10 min，取適量上清液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.1.4 方法學(xué)考察

（1）專屬性的考察。取空白血漿（不加內(nèi)標(biāo)）、PMEA對(duì)照品溶液、空白血漿+PMEA、灌胃給藥2 h后的大鼠血漿樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理后，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，PMEA和內(nèi)標(biāo)能被同時(shí)檢測(cè)，互不干擾，峰形良好，且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾其測(cè)定，基線平穩(wěn)，保留時(shí)間分別為1.06、5.61 min。樣品總離子流圖見圖2。

（2）線性關(guān)系及定量下限考察。取“2.1.2”項(xiàng)下PMEA對(duì)照品溶液適量，稀釋成質(zhì)量濃度為440.0、220.0、110.0、36.6、12.2、6.1 ng/mL的系列溶液。取大鼠空白血漿100 μL，加入上述系列溶液100 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法操作后，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以PMEA峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），PMEA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得到PMEA的回歸方程為y=0.000 6x-0.010 5（r=0.998 5），檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為6.1～440.0 ng/mL，定量下限為6.1 ng/mL。

（3）精密度試驗(yàn)。取大鼠空白血漿100 μL，加入“2.1.4（2）”項(xiàng)下高（440.0 ng/mL）、中（36.6 ng/mL）、低（6.1 ng/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的PMEA溶液100 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法操作，每個(gè)濃度平行6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。3個(gè)質(zhì)量濃度樣品同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度；另外連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3 d，考察日間精密度。結(jié)果，PMEA日內(nèi)RSD均≤6.8%（n=6），日間RSD均≤9.9%（n=3），表明儀器精密度良好。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取大鼠空白血漿100 μL，加入“2.1.4（2）”項(xiàng)下高（440.0 ng/mL）、中（36.6 ng/mL）、低（6.1 ng/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的PMEA溶液100 μL，每個(gè)濃度平行5份，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品處理后室溫放置6 h后，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以考察血漿樣品中PMEA室溫下放置6 h的穩(wěn)定性；再同法制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品，每個(gè)濃度平行3份，于-20 ℃下反復(fù)凍融3次，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以考察血漿樣品中PMEA在反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果，血漿樣品中PMEA于室溫下放置6 h后PMEA峰面積的RSD均≤6.3% （n=5）；經(jīng)-20 ℃下反復(fù)凍融3次后PMEA峰面積RSD均≤7.0%（n=3）。

（5）準(zhǔn)確度及基質(zhì)效應(yīng)考察。取大鼠空白血漿100 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法操作后，加入“2.1.4（2）”項(xiàng)下高（440.0 ng/mL）、中（36.6 ng/mL）、低（6.1 ng/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的PMEA溶液100 μL，每個(gè)濃度平行5份，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法得A樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積A；另取空白血漿100 μL，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理，再向獲得的上清液中加入高（440.00 ng/mL）、中（36.60 ng/mL）、低（6.10 ng/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的混合PMEA溶液和內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镆?50 μL初始流動(dòng)相溶解得B樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積B；另取上述高（440.0 ng/mL）、中（36.6 ng/mL）、低（6.1 ng/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的混合PMEA溶液與內(nèi)標(biāo)100 μL，氮?dú)獯蹈?，殘留物?50 μL初始流動(dòng)相溶解得C樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積C。準(zhǔn)確度計(jì)算方法為峰面積B與峰面積A之比，基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算方法為峰面積B與峰面積C之比。結(jié)果，準(zhǔn)確度為82.16%～97.33%（RSD≤6.4%，n=5）；基質(zhì)效應(yīng)為 95.96%～106.35%（RSD≤4.9%，n=5）。

2.2 藥動(dòng)學(xué)研究

取大鼠12只，隨機(jī)分為ADV組（陽性對(duì)照，90 mg/kg）、PMEA-1c組（160 mg/kg），2組給藥劑量均根據(jù)0.183 mmol/kg PMEA換算而得，每組6只，每日灌胃給藥1次。分別于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h尾靜脈采集約0. 3 mL血液置于涂有肝素的EP管中，6 000 r/min離心10 min，收集上清液。取血漿樣品100 μL于1.5 mL離心管中，按“2.1.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算血漿中PMEA血藥濃度，再利用DAS 2.0軟件擬合計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ADV和PMEA-1c灌胃給藥后PMEA藥-時(shí)曲線見圖3，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。

結(jié)果表明，PMEA -1c灌胃給藥后釋放的PMEA的藥-時(shí)曲線特征符合血管外給藥單室模型。與ADV組比較，PMEA-1c組t1/2、AUC0-24 h、AUC0-∞、cmax均顯著增加（P<0.01或P<0.001），VRT0-24 h、CLz/F顯著減少（P<0.001）；提示PMEA-1c較ADV在大鼠體內(nèi)生物利用度存在一定優(yōu)勢(shì)。

3 討論

本研究建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)大鼠血漿中PMEA的血藥濃度。由于檢測(cè)時(shí)PMEA與葛根素的響應(yīng)度較為接近，葛根素在整個(gè)檢測(cè)過程中性質(zhì)穩(wěn)定，因此選用葛根素作為內(nèi)標(biāo)[11-13]。在該方法下，PMEA與內(nèi)標(biāo)葛根素具有良好的分離度，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣品的測(cè)定沒有干擾，表明該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好，符合生物樣品的檢測(cè)要求。

本實(shí)驗(yàn)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)利用DAS 2.0軟件計(jì)算分析，對(duì)比擬合的單室、二室、三室模型的AIC（赤池信息判據(jù)最小原則，衡量統(tǒng)計(jì)模型擬合優(yōu)良性的標(biāo)準(zhǔn)），其中單室模型AIC最小，因此初步判斷PMEA-1c的代謝為單室模型。ADV、PMEA-1c經(jīng)大鼠灌胃后的tmax分別為0.750、1.000 h，表明這兩種PMEA前藥均可以在較短時(shí)間內(nèi)釋放出PMEA從而發(fā)揮藥效。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ADV單劑量口服在大鼠、小鼠、猴以及狗中，均能迅速釋放原藥PMEA[14-15]，由于PMEA-1c含有相對(duì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，在大鼠體內(nèi)釋放PMEA較慢，這可能是PMEA-1c的tmax較長(zhǎng)的原因之一。PMEA-1c組的cmax較大，AUC0-24 h存在明顯優(yōu)勢(shì)，可能是因?yàn)镻MEA-1c結(jié)構(gòu)中的內(nèi)源性膽酸被膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTCP）特異性識(shí)別，主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)提高了藥物的吸收，也可能正是因?yàn)檫@個(gè)原因，使得PMEA-1c在肝富集，PMEA-1c組的t1/2z [（6.298±1.335） h]比ADV組的t1/2z[（8.309±1.446） h]短，消除更快。

綜上所述，本研究建立的方法準(zhǔn)確可靠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PMEA-1c較ADV在大鼠體內(nèi)生物利用度存在一定優(yōu)勢(shì)，可作為PMEA前藥的潛力藥物，為PMEA前藥的繼續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，但是關(guān)于PMEA-1c的在動(dòng)物體內(nèi)的組織分布以及是否存在腎毒性等還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（收稿日期：2018-11-09 修回日期：2019-02-11）

（編輯：唐曉蓮）