春蘭‘黃梅’ב黃荷’雜交F₁根狀莖的組培快繁研究

漆子鈺 周育真 艾葉 彭東輝

摘要：[目的]篩選春蘭組培各階段的最佳培養(yǎng)條件，建立優(yōu)良的春蘭快繁體系，為春蘭大規(guī)模生產(chǎn)開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。[方法]以春蘭‘黃梅’ב黃荷’F無菌播種形成的根狀莖為試驗材料，通過基本培養(yǎng)基（1/2MS、改良1/2MS、HyponexⅡ）和植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA、NAA、TDZ、IBA）等因子不同組合，圍繞增殖、分化、生根等階段建立其再生體系，并對培育出的組培苗進行移栽練苗。[結(jié)果]增殖最適培養(yǎng)基為3.0g·LHyponexⅡ+0.5mg·L6-BA+3.0mg·LNAA+1.0g·L活性炭（AC）+30.0g·L白砂糖（Su）+7.0g·L瓊脂（Ag），生長速度和增殖系數(shù)分別為7.31和6.02;分化最適培養(yǎng)基為2.0mg·L6-BA+0.3mg·LNAA+30.0g·LSu+7.0g·LAg，分化率、芽誘導(dǎo)個數(shù)和株高分別為90.00%、5.44個和2.53cm;生根最適培養(yǎng)基為1.5mg·LIBA+2.0g·L蛋白胨+1.0g·LAC+25.0g·LSu+7.0g·LAg，生根率、生根數(shù)和平均根長分別為100.00%、8.03條和3.00cm;春蘭組培苗練苗移栽60d后存活率達96.53%。[結(jié)論]新型基本培養(yǎng)基HyponexⅡ（3.0g·L）對春蘭增殖培養(yǎng)有高效促進作用，高水平的IBA（1.5mg·L）有利于春蘭組培苗生根壯苗。

關(guān)鍵詞：春蘭;增殖培養(yǎng);分化培養(yǎng);生根培養(yǎng)

中圖分類號：S682.31文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）09-1032-08

0引言

（研究意義）春蘭Cymbidium goeringii為蘭科Orchidaceae蘭屬Cymbidium的多年生草本植物，是我國蘭科植物（國蘭）中資源最豐富、分布最廣的種類之一，一般于早春開花，花姿優(yōu)美，氣質(zhì)優(yōu)雅，備受國人喜愛，有“天下第一香”和“花中君子”的稱號;然而，高昂的售價與新品種培育周期漫長等問題一直制約著春蘭的規(guī)?；l(fā)展，長期以來國內(nèi)春蘭的商品市場主要依賴日本、臺灣等地的返銷苗，該類苗與原生苗相比存在著成活率差、倒苗等問題。目前蘭花快速繁殖的主要途徑是通過組織培養(yǎng)技術(shù)，因此如何借用組織培養(yǎng)技術(shù)培育開品好、生長周期快的本土優(yōu)良新品種提升產(chǎn)品自信、豐富春蘭市場是解決這一問題最有效的方法。（前人研究進展）近年來關(guān)于國蘭雜交種的組培技術(shù)已有不少報道，常見于‘宋梅’ב集圓’、‘宋梅’ב韓國桃花’和‘春綠蘭’ב虎雪蘭’等;前人對國蘭組培研究的基本培養(yǎng)基多使用MS培養(yǎng)基，后期興起的Hyponex培養(yǎng)基為蘭花組培提供了更為簡便的配制方法，多見于蝴蝶蘭、墨蘭等研究中。（本研究切入點）目前關(guān)于春蘭‘黃梅’ב黃荷’F的研究尚未見報道，同時Hyponex對國蘭生長影響的報道較少，尤其針對春蘭組培的研究僅在簡報中出現(xiàn);此外，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的春蘭對組培條件的需求仍然存在差異，缺少科學(xué)完整且適用于工廠規(guī)?；a(chǎn)的技術(shù)理論，為此，本試驗對春蘭‘黃梅’ב黃荷’F根狀莖及其組培苗的增殖、分化、生根培養(yǎng)和煉苗移栽的關(guān)鍵影響因子進行了相關(guān)研究。（擬解決的關(guān)鍵問題）本試驗選取了穩(wěn)定性強及市場上易獲取的基本培養(yǎng)基（MS和Hypo-nexⅡ）、細胞分裂素（6-BA和TDZ）、生長素（NAA和IBA）和有機添加劑（蛋白胨）為春蘭‘黃梅’ב黃荷’F組培各階段尋找最佳培養(yǎng)條件，旨在建立優(yōu)良、高效的春蘭快繁體系，形成規(guī)模化種植，從而提高春蘭在我國花卉市場的競爭力。

1材料與方法

1.1試驗材料

以2015年9月取自福建連城蘭花股份有限公司的春蘭‘黃梅’ב黃荷’F無菌播種形成的根狀莖為試驗材料。試驗于福建農(nóng)林大學(xué)下安園林植物實驗室進行。

1.2試驗方法

1.2.1增殖培養(yǎng) 采用L（3）正交試驗研究不同基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA對春蘭根狀莖增殖培養(yǎng)的影響（表1），所有處理附加1.0g·L活性炭（AC）+30.0g·L白砂糖（Su）+7.0g·L瓊脂（Ag），pH 5.6-5.8。選取長1.5-2.0cm的健壯根狀莖（五分支）接人上述增殖培養(yǎng)基中。試驗每組接種10瓶，每瓶接種5個材料，2次重復(fù)。光照時間12h'd，培養(yǎng)溫度（26±2）℃，散射光培養(yǎng)，120d后統(tǒng)計根狀莖的生長速度和增殖系數(shù)。

生長速度=（增殖后根狀莖質(zhì)量-接種時根狀莖質(zhì)量）/接種時根狀莖質(zhì)量（1）

增殖系數(shù)=接種根狀莖上新增側(cè)枝數(shù)/接種根狀莖數(shù)（新增根狀莖長度>0.5cm）（2）

1.2.2分化培養(yǎng) 以1/2MS培養(yǎng)基（30.0g·LSu，7.0g·LAg，pH 5.6～5.8）為基本培養(yǎng)基，針對NAA（0.3和0.5mg·L）、6-BA（0.0，1.0，2.0和3.0mg·L）和TDZ（0.0，0.5，1.0和1.5mg·L）配置培養(yǎng)基探索其對春蘭根狀莖分化的影響（表2）。材料選取、接種方式同1.2.1。光照時間12h·d，培養(yǎng)溫度26±2℃，前30d散射光培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入500-1500lx光強下培養(yǎng)，120d后統(tǒng)計根狀莖的分化率和芽誘導(dǎo)個數(shù)。

分化率=分化根狀莖個數(shù)/接種根狀莖數(shù)×100% （3）

芽誘導(dǎo)個數(shù)=誘導(dǎo)出的芽個數(shù)/分化根狀莖數(shù) （新芽>0.5cm） （4）

1.2.3IBA和蛋白胨對組培苗生根的培養(yǎng) 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，對IBA（0.5、1.0和1.5mg·L）和蛋白胨（1.0、2.0和3.0g·L）進行全因素試驗設(shè)計（表3），所有處理附加1.0g·LAC+25.0g·LSu+7.0g·LAg（pH 5.6-5.8），研究其對株高（6±2）cm組培苗（無根）生根的影響。每組接種10瓶，每瓶接種3株，重復(fù)2次。光照時間12h·d，培養(yǎng)溫度（26±2）℃，光強500-1000k，120d后統(tǒng)計根狀莖的生根率和生根數(shù)。

生根率=生根株數(shù)/接種株數(shù)×100% （5）

生根數(shù)=生根根條數(shù)/生根株數(shù)

（每條根長度>0.5cm） （6）

1.2.4煉苗移栽 選取生長健壯、葉色正常，株高（10±2）cm，根皮色白中帶綠、無黑色、畸形、變異的組培苗為試驗材料，清凈根部培養(yǎng)基，在陰涼處晾干2d，移栽至樹皮（2-3cm）和火燒石等體積混合的基質(zhì)中，60d后觀察生長狀態(tài)并統(tǒng)計成活率.

成活率=成活的株數(shù)/移栽株數(shù)×100% （7）

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用Excel 2010計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和Least-Significant Difference（LSD）多重比較，水平0.01

2結(jié)果與分析

2.1基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA對根狀莖增殖的影響

接種時根狀莖上無明顯凸起（圖1-A），培養(yǎng)15d后有明顯萌動，新萌動的根狀莖向下扎入培養(yǎng)基中（圖1-B），培養(yǎng)120d時根狀莖數(shù)量明顯增多，且新生根狀莖亦會出現(xiàn)分支現(xiàn)象（圖1-C）。

由表4可知：比較生長速度和增殖系數(shù)指標(biāo)中各因素R值，均表明基本培養(yǎng)基的影響高于6-BA和NAA，6-BA對生長速度的影響大于NAA，NAA對增殖系數(shù)的影響大于6-BA。

通過極差分析得出：最有利于根狀莖生長的培養(yǎng)基為3.0g·LHyponexⅡ+0.5mg·L6-BA+3.0mg·LNAA（即處理9）;有利于提高根狀莖增殖系數(shù)的培養(yǎng)基為：1/2MS+0.3mg·L6-BA+5.0mg·LNAA。方差分析表明：基本培養(yǎng)基（P=0.000<0.01）和6-BA（P=0.005<0.01）對春蘭根狀莖生長速度的影響極顯著，NAA的影響不顯著;基本培養(yǎng)基（P=0.009<0.01）對春蘭增殖系數(shù)的影響極顯著，6-BA和NAA的影響不顯著。

進一步用LSD多重比較不同水平的基本培養(yǎng)基和6-BA對根狀莖生長速度的影響：3.0g·LHyponexⅡ與1/2MS（P=0.000<0.01）、改良1/2MS （P=0.000<0.01）之間差異極顯著，后兩者之間差異不顯著;0.1mg·L6-BA與0.5mg·L6-BA差異極顯著（P=0.005&lt;0.01），0.3mg·L6-BA與其他2個濃度之間差異不顯著。進一步用LSD多重比較不同水平的基本培養(yǎng)基對根狀莖增殖系數(shù)的影響：1/2MS和3.0g·LHyponexⅡ?qū)υ鲋诚禂?shù)差異極顯著（P=0.002<0.01），改良1/2MS與前兩者之間差異不顯著。由此可見：缺少微量元素的1/2MS對根狀莖增殖培養(yǎng)無明顯促進作用;HyponexⅡ?qū)Ρ?/2MS更有利于春蘭根狀莖的增殖培養(yǎng);1/2MS更有利于促進春蘭根狀莖的分支生長;6-BA濃度的升高有利于春蘭根狀莖的誘導(dǎo)。

2.2NAA、6-BA和TDZ對根狀莖芽分化的影響

接種時1.5-2.0cm的根狀莖上無明顯的芽點凸起（圖1-D），培養(yǎng)30d后誘導(dǎo)出肉眼可見的向上生長的芽（圖1-E），培養(yǎng)120d時根狀莖上形成了葉片2片以上的春蘭小苗（圖1-F）。

由表5可知：有6-BA參與的處理中，0.3mg·L水平的NAA比0.5mg·L水平分化率更高;有TDZ參與的處理中，1.0mg·LTDZ更有利于提高分化率。芽誘導(dǎo)個數(shù)最多的是處理2（5.44個），其次為處理3（4.90個），處理9的芽誘導(dǎo)個數(shù)最少（3.09個），12個處理中0.3mg·LNAA的芽誘導(dǎo)個數(shù)普遍比0.5mg·LNAA更多，有TDZ參與的處理中，1.0mg·LTDZ更有利于提高芽誘導(dǎo)個數(shù)。1.0mg·L6-BA時株高保持了較高高度，處理7達2.77cm，處理1達2.70cm，處理6的株高最低（1.06cm），隨著6-BA或者TDZ的濃度升高，株高隨之降低。

方差分析表明：NAA對春蘭根狀莖的分化率（P=O.000<0.01）、芽誘導(dǎo)個數(shù)（P=0.000<0.01）和株高（P=0.001<0.01）的影響極顯著;6-BA（p=0.000<0.01）對株高的影響極顯著，對分化率和芽誘導(dǎo)個數(shù)的影響不顯著;TDZ對根狀莖的分化率（P=0.000<0.01）和株高（P=0.000<0.01）的影響極顯著，對芽誘導(dǎo)個數(shù)不顯著。

處理1、2和3的芽分化效果都較好，但高濃度的6-BA（3.0mg·L）不利于組培苗株高的伸長;處理2的分化率較處理1低8%，芽誘導(dǎo)個數(shù)平均多出1.37個芽，株高上無明顯差異;考慮需高效的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)組培苗轉(zhuǎn)接至生根壯苗培養(yǎng)，分析可知12組處理中處理2培養(yǎng)基最適合誘導(dǎo)芽的分化。

2.3IBA和蛋白胨對組培苗生根的影響

接種時組培苗底部豎向插入培養(yǎng)基適當(dāng)深度，培養(yǎng)120d時組培苗底部的假鱗莖周邊新生出若干的肉質(zhì)根，同時葉片適當(dāng)?shù)纳扉L變壯（圖1-G）。

由表6可知：隨著IBA濃度升高，生根率呈逐漸升高的趨勢，處理8的生根率（100.00%）和生根數(shù)（8.03條）都表現(xiàn)最好。方差分析表明：IBA對生根率（P=0.031<0.05）和生根數(shù)（P=0.036<0.05）影響顯著，對平均根長（P=0.006<0.01）影響極顯著;蛋白胨對生根率、生根數(shù)和平均根長影響不顯著;IBA和蛋白胨對平均根長（P=0.000<0.01）影響極顯著，對生根率和生根數(shù)影響不顯著。

進一步用LSD多重比較IBA的3個不同水平對生根率的影響：0.5mg·L和1.5mg·L之間差異顯著（P=0.006<0.01），1.0mg·L和前兩者之間差異不顯著.進一步用LSD多重比較IBA的3個不同水平對生根數(shù)的影響：0.5mg·L和1.5mg·L之間差異顯著（P=0.027<0.05），1.0mg·L和前兩者之間差異不顯著。進一步用LSD多重比較IBA的3個不同水平對平均根長的影響：0.5mg·L和1.0mg·L（P=0.004<0.01）、1.5mg·L（P=0.001<0.01）之間差異極顯著，后兩者之間差異不顯著。表明在一定范圍內(nèi)，IBA濃度的升高有利于提高春蘭組培苗的生根率、生根數(shù)和根長的生長。

2.4煉苗移栽

春蘭組培苗在樹皮（2-3cm）和火燒石等體積混合的基質(zhì)中移栽60d后，存活率達96.53%（圖1-H）。

3討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1增殖的影響 增殖培養(yǎng)在蘭花組培中是至關(guān)重要的一環(huán)，有研究表明春蘭對培養(yǎng)基中無機鹽濃度要求較低，若長時間繼代培養(yǎng)1/2MS較合適，近年來對春蘭組織培養(yǎng)廣泛使用的基本培養(yǎng)基多為MS;有研究指出春蘭、蕙蘭、建蘭適合培養(yǎng)在低水平的無機鹽和氨態(tài)氮培養(yǎng)基中，若長期繼代培養(yǎng)以1/2MS為宜，寒蘭、墨蘭則適合培養(yǎng)在高水平的無機鹽培養(yǎng)基中。在前人的研究基礎(chǔ)上，本試驗采用正交設(shè)計了多因素共同作用對根狀莖增殖的影響，對低水平的無機鹽（1/2MS）進行了改良，結(jié)果表明缺少微量元素對春蘭根狀莖的增殖未起到促進作用;目前關(guān)于Hyponex對春蘭根狀莖增殖影響的研究報道較少，在鄭艷艷對墨蘭‘奇花’的研究中表明，當(dāng)MS和Hyponex同時添加2.0mg·LBA+0.1mg·LNAA+1.0g.L蛋白胨時，HyponexΙ和HyponexⅡ混合使用時的增殖效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基;本試驗結(jié)果顯示HyporlexⅡ的參與對比MS、6-BA和NAA起到了明顯的促進作用，甚至大過植物生長調(diào)節(jié)劑在增殖階段的優(yōu)勢，但若缺少合適的生長調(diào)節(jié)劑配合，根狀莖多短小似桑葚狀聚集在一起。由此可知，春蘭根狀莖對無機鹽、植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇與濃度之間具有緊密聯(lián)系，Hyponex作為基本培養(yǎng)基時需要配合適當(dāng)?shù)闹参锷L調(diào)節(jié)劑引導(dǎo)根狀莖伸長。

一般在增殖繼代培養(yǎng)階段，生長素（NAA、IBA等）與細胞分裂素（BA、TDZ等）的所需量成反比，即生長素相對較多，細胞分裂素相對需求較少，同時也要注意生長素和細胞分裂素之間的平衡關(guān)系。孫芳對‘如意素’ב集園’的研究表明當(dāng)0.5mg·L6-BA+2.0mg·LNAA時為最佳增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為5.25，當(dāng)IBA替代NAA即0.1mg·L6-BA+2.0mg·LIBA時增殖系數(shù)為4.38;劉幸佳對‘宋梅’的研究表明當(dāng)0.1mg·L6-BA與1.0mg·LIBA或5.0mg·LNAA搭配時為最佳增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)均為5.8;牛田對‘金荷鼎’與‘赤蕙’的研究表明當(dāng)0.5mg·L6-BA+1.0mg·LNAA時為最佳增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為5.67。在前人的研究基礎(chǔ)上，本試驗根據(jù)規(guī)律選取了低濃度6-BA搭配高濃度NAA對春蘭進行增殖培養(yǎng)研究，最高增殖系數(shù)可達7.40;在實際生產(chǎn)中蘭花根狀莖的生長速度與增殖系數(shù)是同樣重要的一項評判標(biāo)準(zhǔn)，因此對比前人研究，本試驗增加了生長速度的評判因子，本研究結(jié)果顯示，春蘭根狀莖在3.0g·LHyponexⅡ+0.5mg·L6-BA+3.0mg·LNAA（處理9）中生長速度遠遠快于其他處理，增殖系數(shù)處于中間值，在保障一定增殖系數(shù)的條件下，生長速度快的處理可解決春蘭在組培快繁期間培養(yǎng)周期長的問題，即可實現(xiàn)一年內(nèi)2次轉(zhuǎn)接增至3次，此配方不僅提高了增殖系數(shù)，同時縮短了增殖培育時間。此外，結(jié)合本試驗多重比較的結(jié)果針對該雜交春蘭增殖階段可繼續(xù)嘗試6-BA濃度高于0.5mg·L的研究。

3.1.2芽分化的影響 影響根狀莖芽分化的因素是比較復(fù)雜的，除去生長調(diào)節(jié)劑的作用，還與活性炭和外援添加物有著密不可分的關(guān)系。王永清等研究表明高水平6-BA（2.0mg·L）與低水平NAA（0.5mg·L）有利于春蘭芽的分化，高水平NAA（2.0mg·L）有利于根的誘導(dǎo);在前人的研究基礎(chǔ)上，本試驗僅針對生長調(diào)節(jié)劑（NAA、6-BA、TDZ）進行了探討：0.3mg·LNAA的分化效果整體優(yōu)于0.5mg·L，研究中最低水平的6-BA（1.0mg·L）和NAA（0.3mg·L）分化率最高（98%），但在規(guī)模化生產(chǎn)中分化階段考慮的不僅僅是分化率，需同時考慮芽誘導(dǎo)個數(shù)和株高等評判因子，綜合考慮較優(yōu)組合為2.0mg.L6-BA+0.3mg.LNAA。本試驗還對TDZ進行了探討，目前關(guān)于TDZ對春蘭根狀莖分化培養(yǎng)階段的影響未見報道，多集中在國蘭的增殖培養(yǎng)階段，劉映雯對蓮辦蘭的研究結(jié)果表明TDZ高效的細胞分裂活性在其芽分化階段優(yōu)于6-BA，在本研究中在同為細胞分裂素的TDZ替代6-BA的情況下，高濃度的TDZ（0.5-1.5mg·L）不利于春蘭的分化，這可能是不同蘭屬在芽分化階段對生長調(diào)節(jié)劑的需求有著一定的差異，在實際應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)不同品種不同階段進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，同時在后期的研究中可適當(dāng)降低TDZ濃度對春蘭分化繼續(xù)進行探討。

3.1.3生根的影響 IBA是組培植物生根壯苗的關(guān)鍵。李玉萍利用正交試驗對比了IBA、NAA和BA對‘宋梅’ב韓國桃花’生根的影響，其研究結(jié)果表明對平均根數(shù)的影響大小為IBA>NAA>BA，同時表明不添加或低濃度的有機質(zhì)對雜交蘭幼根生長更有利;卜朝陽的研究也表明了在0.1mg·L6-BA+0.5mg·LNAA的基礎(chǔ)上，添加0.2mg.LIBA更有利于蝴蝶蘭生根。本試驗經(jīng)過120d的培養(yǎng)，結(jié)果表明IBA有利于春蘭生根培養(yǎng)，且高水平IBA（1.5mg.L）對春蘭根部生長更有利;該研究結(jié)果與魏韓英對春蘭‘宋梅’生根的研究結(jié)果相反，其認(rèn)為在添加0.1mg·L6-BA+0.5/1.0/2.0mg·LIBA的全因素處理中，低濃度IBA（0.5mg.L）生根效果最好，這可能是因為降低無機鹽濃度改變了植物體內(nèi)的滲透壓，從而影響了植物體的代謝。本研究結(jié)果顯示蛋白胨濃度對春蘭組培苗生根的影響很小，這可能由于培養(yǎng)基中氮源已經(jīng)充足，1.0-3.0g·L水平的蛋白胨不是春蘭生根的關(guān)鍵。

3.2結(jié)論

本試驗從不同基本培養(yǎng)基（MS和Hyponex）、細胞分裂素（6-BA和TDZ）、生長素（NAA和IBA）和有機添加劑（蛋白胨）對春蘭‘黃梅’ב黃荷’雜交根狀莖組培快繁各階段進行了研究。結(jié)果表明：增殖最適培養(yǎng)基為3.0g·LHyponexⅡ+0.5mg·L6-BA+3.0mg.L NAA+1.0g·LAC+30.0g.LSu+7.0g·LAg，生長速度和增殖系數(shù)分別為7.31和6.02;分化最適培養(yǎng)基為2.0mg·L6-BA+0.3mg·LNAA+30.0g.LSu+7.0g.LAg，分化率、芽誘導(dǎo)個數(shù)和株高分別為90.00%、5.44個和2.53cm;生根最適培養(yǎng)基為1.5mg·LIBA+2.0g·L蛋白胨+1.0g.LAC+25.0g.LSu+7.0g.LAg，生根率、生根數(shù)和根長分別為100.00%、8.03條和3.00cm;練苗移栽60d后存活率達96.53%。