LC-MS/MS法測定石斛堿在大鼠體內(nèi)藥代動力學研究

白俊其　黃娟　徐文　張靖　宮璐　黃志海　丘小惠

摘要 目的：建立LC-MS/MS分析方法測定大鼠血漿中石斛堿濃度，考察其體內(nèi)藥代動力學特征。方法：SD大鼠6只灌胃給予石斛堿（20 mg/kg），于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、90.120、180、240、420、600、1 440 min眼內(nèi)眥靜脈從取血，測定大鼠血漿石斛堿濃度。用DAS2.0統(tǒng)計軟件計算藥動學參數(shù)。結(jié)果：石斛堿濃度在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好（r2=0.999 2），定量下限為0.5 ng/mL，低（1 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（20 ng/mL）3個濃度的回收率分別為（78.86±4.56）%、（85.25±1.23）%及（80.56±2.23）%;日內(nèi)及日間RSD均小于10%。石斛堿給藥后血藥濃度-時間曲線符合二室模型，消除半衰期為t1/2為（51.27±2.65）min，Tmax為（10.00±0.17）min，Cmax為（0.12±0.08）mg/L，AUC（0-∞）為（7.91±0.25）mg/L·min。結(jié)論：本分析方法對石斛堿體內(nèi)外檢測具有專屬性，且靈敏、可靠，適用于石斛堿藥代動力學研究。

關鍵詞 石斛堿;藥代動力學;血藥濃度;LC-MS/MS

Pharmacokinetics of Dendrobin in Rats by LC-MS/MS

Bai Junqi，Huang Juan，Xu Wen，Zhang Jing，Gong Lu，Huang Zhihai，Qiu Xiaohui

（The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch，Guangzhou 510006，China）

Abstract Objective：To establish an LC-MS/MS method for determination of dendrobine， and to study the pharmacokinetics of dendrobine in rats.Methods：Six male rats were orally administered with Dendrobium（20 mg/kg），Plasma samples were collected at 5、15、30、45、60、90.120、180、240、420、600、1440 min after the drug administration.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS2.0 software.Results：The calibration curves were linear over the concentration ranging from 0.5 to 50 ng/mL（r2=0.9992）with the LLOQ of 0.5 ng/mL.The intraday and interday RSD were generally good（<10%）.The concentration-time curve for dendrobine was in accordance with the two-compartment model， The main pharmacokinetic parameters t1/2， Tmax， Cmax， AUC（0-∞）were as follows：（51.27±2.65）min，（10.00±0.17）min，（0.12±0.08）mg/L， （7.91±0.25）mg/L·min.Conclusion：The analytical method developed is sensitive specific rapid and reproducible and is proved to be suitable for the pharmacokinetic study of dendrobine.

Key Words Dendrobine;Pharmacokinetics;Blood Concentration;LC-MS/MS

中圖分類號：R284.2文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.010

金釵石斛是名貴中藥，為蘭科石斛屬植物金釵石斛（Dendrobium.nobile Lindl）的新鮮或干燥莖，它作為中藥石斛的基原植物之一被收入《中華人民共和國藥典》[1]。有研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛具有抗衰老、抗腫瘤及增強免疫功能等作用[2-3]。金釵石斛含有生物堿、倍半萜、聯(lián)芐、菲類、多糖等多種類型的化學成分[4-7]。早在1932年鈴木秀干等于金釵石斛中首次分離得到石斛堿[8]。1935年陳克恢再于金釵石斛中獲得石斛堿[9]，石斛堿是一種倍半萜類生物堿[10]，是石斛總堿中含量最高的[11-12]，石斛堿具有止痛、解熱、降低心率和血壓、減慢呼吸、使血糖中度升高、解巴比妥毒及緩解白內(nèi)障等作用[13-15]，具有較高的研究開發(fā)價值。關于石斛堿藥效學研究已有很多報道，對于石斛堿藥代動力學研究較少，僅有一篇石斛堿尾靜脈注射后藥代動力學研究[16]，目前尚無對石斛堿口服后其藥代動力學研究的報道，本文建立LC-MS/MS法測定石斛堿在大鼠血漿血藥濃度變化，研究口服石斛堿后其在大鼠體內(nèi)藥代動力學，為進一步開發(fā)金釵石斛相關產(chǎn)品提供依據(jù)，對于提高藥物的療效和安全性有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Xcalibur樣品分析系統(tǒng)，Lcquan 2.6定量處理軟件，Elix5型純水機（美國Millipore公司），XW-80A型渦旋混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠），Eppendorf高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），步琪R210型真空濃縮儀（瑞士步琪公司）。

1.2 實驗藥品與試劑

對照品石斛堿（批號：111876-201102）及內(nèi)標氯雷他定（批號：100615-201404）均購于中國藥品生物制品檢定所，受試石斛堿（實驗室自制，純度>95%），乙腈、甲醇（色譜純，merck公司），超純水為自制（經(jīng)Milli-Q純水器凈化）。

2 方法

2.1 LC-MS條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱Agilent Poroshell120 SB-C18（2.1×100 mm，2.7 μm）;流速：200 μL/min，進樣量5 μL;流動相：乙腈（C）-水（A），梯度洗脫（0～2 min，5%～30%;2～4 min，30%～60%;4～7 min，60%～95%）。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）;離子檢測方式：SRM;離子極性：正離子;Capilary Temperayure：350 ℃;Vaporizer Temperature：250 ℃;Sheath Gas Pressure（Arb）：30;Aux Gas Pressuer（Arb）：15;Ion Sweep Gas Pressure（Arb）：0;positive Polarity：3000。用于定量的離子對264.15/105.08，176.17，218.20;碰撞能量分別為34，34，25;內(nèi)標氯雷他定離子對383.00/267.00，碰撞能量28。

2.2 溶液配制

2.2.1 石斛堿標準溶液配制 精密稱取石斛堿適量，加入適量甲醇溶解配制成100 ng/mL標準液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1 石斛堿溶液配制 精密稱取石斛堿樣品20.00 mg，加入80 mL超純水，配制成濃度為0.25 mg/mL溶液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 內(nèi)標溶液配制 精密稱取氯雷他定適量，加入適量甲醇溶液配制成1 mg/mL的內(nèi)標液，精密量取上述內(nèi)標液適量，加入適量甲醇溶液并稀釋得到1 ng/mL內(nèi)標液。

2.3 方法專屬性

取空白甲醇溶液、空白血漿、空白血漿加石斛堿、內(nèi)標氯雷他定、10 min血漿樣品，分別經(jīng)LC-MS檢測后，記錄色譜圖，考察專屬性。

2.4 線性關系考察

精密量取200 μL空白血漿，加入8 μL內(nèi)標液，加入192 μL對照品溶液，加入400 μL甲醇，按2.7項下的方法操作后進樣，配成石斛堿終濃度為50、20、10、5、2、1、0.5 ng/mL對照品溶液，進樣5 μL經(jīng)LC-MS測定，記錄峰面積。

2.5 精密度和準確性實驗

配制低、中、高3個濃度為1、5和20 μg/mL的石斛堿含藥血漿并繪制相應隨行曲線，每批每濃度各5份及1條隨行曲線，2.7項下方法操作后進行分析，在1 d內(nèi)分別測定5份樣品，計算日內(nèi)精密度;每天各測一份樣品，連測5 d，計算日間精密度。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取1、5和20 μg/mL的石斛堿含藥血漿，分別置室溫12 h、進樣器內(nèi)8 h，-70 ℃冰箱凍融3次，各條件同一濃度平行處理3份測定。

2.7 回收率實驗

配制低、中、高3個濃度為1、5和20 μg/mL的石斛堿含藥血漿溶液，每濃度5份，按5.5項下方法操作后進樣分析，分別記錄血漿樣本及標準溶液的石斛堿色譜峰面積A1及A2，以A1/A2×100%計算回收率。

2.8 血漿樣品處理

精密量取大鼠200 μL血漿，加入8 μL內(nèi)標液，加入592 μL甲醇，振蕩3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，取上清液5 μL進樣。

2.9 給藥方法與血樣采集

SD大鼠6只，于實驗前晚禁食，期間可自由飲水。以0.3%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配成含石斛堿2.0 mg/mL混懸液，給藥體積10 mL/kg。灌胃給藥前，經(jīng)大鼠眼眶靜脈叢采集血樣約0.5 mL，作為空白對照。并分別于灌胃給藥后5、15、30、45、60、90.120、180、240、420、600、1 440 min采集血樣0.5 mL。置1.5 mL抗凝離心管中，10 000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.10 動力學參數(shù)計算

將各個測定數(shù)據(jù)列成不同時間血藥濃度數(shù)據(jù)表，求出均值及標準差（±s）。將每個動物血藥濃度（C）與時間（t）數(shù)據(jù)用藥代動力學計算程序DAS2.0進行C-t曲線擬合，并計算出每個動物有關藥代動力學參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 方法學評價

3.1.1 專屬性

本實驗色譜條件下，石斛堿出峰時間在4.39 min，內(nèi)標氯雷他定出峰時間在6.12 min，峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對兩者的測定無干擾，基線平穩(wěn)。見圖1。

3.1.2 線性及靈敏度

以石斛堿的濃度C（ng/mL）為橫坐標進行線性回歸，權(quán)重系數(shù)1/C2，得標準曲線的回歸：Y=0.123X+0.071，r2=0.999 2（n=6）線性范圍為0.5～50 ng/mL，定量下限為0.05 ng/mL。

3.1.3 精密度實驗

高、中、低濃度生物樣品日內(nèi)、日間峰面積與內(nèi)標物峰面積之比RSD<10%，精密度良好。見表1。

3.1.4 穩(wěn)定性實驗

生物樣品置室溫12 h、進樣器內(nèi)8 h，-70 ℃冰箱凍融3次，測定對照品和內(nèi)標物峰面積，各濃度樣品測定值的RSD均小于10%，說明在個條件下穩(wěn)定性良好。

3.1.5 加樣回收率實驗

高、中、低濃度生物樣品回收率大于70%，滿足生物樣品分析檢測要求。見表2。

3.2 藥代動力學

6只大鼠按5.4項下給予石斛堿混懸液，測定不同時間點血漿藥物濃度。見圖2。以二室模型統(tǒng)計矩方法，計算藥代動力學參數(shù)，主要動力學參數(shù)見表3。

4 討論

石斛堿為金釵石斛指標性成分，在總生物堿中含量是最高的成分，藥理活性較好，但對于分離純化大多借助高效液相等儀器，本文采用酸水提取，石油醚萃取，然后經(jīng)正相層析法及結(jié)晶法可從金釵石斛中得到較大量純化石斛堿，整個過程操作簡單，對石斛堿大生產(chǎn)提供思路。

本實驗建立測定體內(nèi)外石斛堿LC-MS/MS法，具有很高的專屬性，每一樣品的分析時間只需7 min。在所建立的色譜分離條件下，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)及代謝物不干擾樣品測定。此法靈敏度高，方法的重現(xiàn)性好，操作簡便、結(jié)果準確，儀器定量下限可以達到0.5 ng/mL，適合石斛堿體內(nèi)外藥物分析。本研究主要考察自制石斛堿灌胃給予在大鼠體內(nèi)血藥濃度-時間變化趨勢，大鼠灌胃給予石斛堿后藥代動力學為二室模型，t1/2α為2.24 min，Tmax為10 min，均表明石斛堿迅速自胃腸道吸收入血。t1/2β為51.27 min，遠大于t1/2α，說明石斛堿在體內(nèi)主要以消除過程為主，且消除過程較快，在體內(nèi)不易引起蓄積。

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（2017-05-09收稿 責任編輯：張雄杰）