乙醛脫氫酶2對(duì)肥胖大鼠心肌的影響

于曉涵

摘要：隨著國(guó)民生活水平的提高，高脂飲食伴隨的生活習(xí)慣逐漸成為大眾主流。研究發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶2（ALDH2）是一種在心肌保護(hù)方面具有重要作用的醛類氧化酶，能夠改善心肌損傷和動(dòng)脈粥樣硬化等。因此，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飲食構(gòu)建肥胖大鼠模型，探討ALDH2和心肌保護(hù)間的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：高脂飲食;心肌;乙醛脫氫酶2

1 前言

社會(huì)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，帶動(dòng)了國(guó)民的物質(zhì)水平不斷提高。中國(guó)居民的膳食習(xí)慣正在向以高脂飲食為主的西方膳食模式轉(zhuǎn)變，特別是在大城市，這種現(xiàn)象更為顯著。伴隨著人們膳食金字塔的改變，一系列慢性病的發(fā)病率不斷攀升，尤其是長(zhǎng)期進(jìn)食高脂食物可以增加冠心病的發(fā)病率。流行病學(xué)資料顯示，中國(guó)城市居民冠心病死亡率高達(dá)88.71/10萬(wàn)，以每年20%的速度增長(zhǎng)。并且出現(xiàn)地區(qū)和性別差異，城市高于農(nóng)村，男性高于女性，在發(fā)達(dá)的沿海城市這種情況更為顯著[1]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是由冠狀動(dòng)脈血管變窄或被阻塞使得心肌缺氧或梗死而引起的心臟病，簡(jiǎn)稱冠心病，又被稱為缺血性心臟病。過(guò)量攝入高脂食物后，會(huì)造成膽固醇和甘油三脂長(zhǎng)期處于高水平狀態(tài)，容易使動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化，引發(fā)心臟內(nèi)的血液供給不足，致使心肌受損，最終引發(fā)冠心病。由于高脂食物中含有較多的飽和脂肪酸，經(jīng)科學(xué)證實(shí)攝入飽和脂肪酸的量越多，冠心病的患病率就越大，二者呈正相關(guān)。冠心病已經(jīng)影響到人類的生活質(zhì)量，成為影響身體健康的首要危險(xiǎn)因素。因此如何降低高脂飲食模式對(duì)冠心病的發(fā)病率是目前亟待解決的重要問(wèn)題。

乙醛脫氫酶（ALDH）是醛脫氫酶中的一種，包含19個(gè)成員，每個(gè)成員由不同的染色體上基因編碼。ALDH一共包括三類，存在于線粒體上的乙醛脫氫酶2（ALDH2）是其中的第二類。ALDH2是一種重要的醛類氧化酶，具有脫氫酶和酯酶的功能，能夠催化乙醇的代謝產(chǎn)生乙醛并將其氧化為醋酸，然后將乙醛衍生物4-羥壬烯醛（4-HNE）氧化分解，生成無(wú)毒的酸，減輕活性氧和醛類氧化酶生成對(duì)細(xì)胞造成的損傷[2]。研究表明，ALDH2是不僅是酒精代謝的關(guān)鍵酶，還可以保護(hù)由氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷。另有研究表明，在缺血再灌注損傷中，隨著ALDH2活性的提高，心梗出現(xiàn)的面積就越小，呈現(xiàn)反關(guān)系，證實(shí)ALDH2具有改善心臟功能，保護(hù)心肌的重要作用。目前關(guān)于冠心病與ALDH2的基因多態(tài)性之間的關(guān)系有很多研究。從它的生物學(xué)特性來(lái)看，ALDH2基因的12 號(hào)外顯子的鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰蕰r(shí)，此時(shí)谷氨酸被替換為賴氨酸，根據(jù)該突變，ALDH2基因型在人群中就形成了3種組合方式：GG型（野生純合子）、GA型（雜合子）和AA型（突變純合子）。國(guó)內(nèi)外在這兩者的關(guān)系上有大量研究，有研究者選取了89名心?；颊吆?42名不穩(wěn)定型心絞痛患，把231名患者分為ALDH2*1/ALDH2*1型（n=145）和ALDH2*1/ALDH2*2，ALDH2*2/ALDH2*2型（n=86）兩組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變型患者心梗發(fā)病率高于野生型患者。日本的一項(xiàng)研究顯示，ALDH2突變基因型成為了日本男性心梗的危險(xiǎn)因素之一。但是進(jìn)一步研究顯示，ALDH2的突變型基因只是心梗發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，與冠狀動(dòng)脈損傷的嚴(yán)重等級(jí)沒(méi)有關(guān)聯(lián)。研究提示，存在ALDH2*2等位基因的人患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)更高，并且攜帶ALDH2*2的基因是心肌梗死和急性冠脈綜合癥中的主要危險(xiǎn)因子，可能與ALDH2 活性降低后導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)積累、蛋白質(zhì)合成受阻、活性氧增加等因素有關(guān)，不過(guò)具體的機(jī)制尚未明確。在既往的研究中顯示，ALDH2活性的提高可以減慢動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，減輕乙醇對(duì)肝臟的損傷，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)酒精中毒可以起到解毒和治療的作用?？偨Y(jié)以上探究，ALDH2與心血管疾病密切相關(guān)，如冠心病，缺血再灌注損傷等。所以研究ALDH2在心血管疾病治療方面的作用具有很重要的臨床價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)高脂飲食構(gòu)建肥胖大鼠模型，同時(shí)結(jié)合血清中總膽固醇（TC）和肌酸激酶（CK）的變化，探討ALDH2和心肌保護(hù)間的關(guān)系，為臨床降脂和心肌保護(hù)提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠雄性24只，2月齡，體重約290g。購(gòu)于湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。所有大鼠均自由進(jìn)食，室溫 21±4攝氏度下飼養(yǎng)。

2.1.2儀器和試劑

其林貝爾脫色搖床;垂直電泳槽1.5MM標(biāo)配;VE-180轉(zhuǎn)移電泳槽;高壓電泳儀電源;多功能酶標(biāo)儀;超級(jí)恒溫水浴鍋;小型冷凍高速離心機(jī);電磁攪拌器;上海勤翔超敏熒光及化學(xué)反應(yīng)儀;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī);優(yōu)普超純水制造系統(tǒng);制冰機(jī)。由武漢萬(wàn)知生物有限公司提供BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒;南京建成生物有限公司提供總膽固醇和肌酸激酶試劑測(cè)試盒。

2.1.3 取材

在干預(yù)后用戊巴比妥鈉麻醉后，取心肌組織于-80℃冰箱中冷凍。通過(guò)眼球取血5ml靜置30min后放于4℃冷柜過(guò)夜，隔天用1000轉(zhuǎn)/分鐘*10分鐘的模式進(jìn)行離心，離心后取上層血清保存于-20℃的低溫環(huán)境中。

2.2方法

2.2.1高脂乳劑的配制

取500ml規(guī)格的燒杯，將20g豬油放在燒杯中用磁力攪拌器加熱到100℃后，加入2g膽固醇，用玻璃棒不斷攪拌使其熔化，再加入2g膽酸鈉攪拌使其溶解。再取一個(gè)500ml規(guī)格的燒杯，把20ml吐溫-80和20ml丙二醇倒入燒杯中用磁力攪拌器加熱至60℃，然后加入1g丙硫氧嘧啶。等到丙硫氧嘧啶充分溶解后，將兩個(gè)燒杯中的液體混勻。

2.2.2實(shí)驗(yàn)分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后的大鼠隨機(jī)抽取8只作為普食對(duì)照組（ND）提供標(biāo)準(zhǔn)飼料，另外16只給予高脂乳劑。并再將其隨機(jī)分為兩組，即高脂對(duì)照組（持續(xù)灌高脂乳劑，HR）、飲食限制組（DR，前四周喂食高脂乳劑，后四周喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料）。八周后進(jìn)行取材。

2.2.3 總膽固醇指標(biāo)檢測(cè)

南京建成公司試劑盒提供的酶標(biāo)儀測(cè)試方法：在空白孔，標(biāo)準(zhǔn)孔和校準(zhǔn)孔中分別加入2.5微升的雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本;接著將所有孔中加入250微升的工作液;混勻96孔板中各孔的液體;37℃孵育10分鐘;用酶標(biāo)儀設(shè)置510nm的參數(shù);依據(jù)公式計(jì)算吸光度。

2.2.4 肌酸激酶活力測(cè)試

南京建成公司試劑盒提供的酶標(biāo)儀測(cè)試方法：測(cè)定管中加入20微升的待測(cè)樣本;接著將300微升的混合試劑分別加入測(cè)定管和對(duì)照管中;振蕩混勻，37攝氏度，水浴20分鐘。水浴之后，在對(duì)照管中加入20微升的待測(cè)樣本，接著把試劑六分別加入兩種管里，振蕩混勻，每分鐘500轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)10分鐘，取上清加入定磷劑?；靹騼蓚€(gè)管中的液體，浴調(diào)至45℃加熱15分鐘。雙蒸水調(diào)零設(shè)定參數(shù)660nm，測(cè)各管的吸光度。

2.2.5 Western blot法測(cè)定ALDH2蛋白表達(dá)

①提取心肌組織中的總蛋白：稱取大鼠心肌組織，將其剪成小塊;加入蛋白酶抑制劑液和蛋白裂解液2ml，充分研磨;用超聲將細(xì)胞裂解后離心10分鐘，離心后用取上清;加入Loading Buffer后煮樣5分鐘;BCA法測(cè)定蛋白濃度。②配制SDS-PAGE凝膠：配制前將兩塊玻璃板安裝完畢，將配好得分離膠試劑（去離子水，2-丙烯酰胺，Tris-Hcl 8.8PH，SDS，過(guò)硫酸銨AP，TEMED）快速混勻，抓緊注入玻璃板間隙，直至玻璃板2/3高度，蒸餾水封膠，靜置半小時(shí)后，倒掉水;接著把濃縮膠混合液（去離子水，2-丙烯酰胺，Tris-Hcl 6.8PH，SDS，過(guò)硫酸銨AP，TEMED）注入玻璃板間隙中直至小玻璃板位置;插入梳子，靜置1小時(shí)后上樣。③電泳：85v電壓下跑膠。④轉(zhuǎn)膜：撬開(kāi)兩塊玻璃，去掉上層濃縮膠，只留分離膠，將分離膠放入轉(zhuǎn)膜液中;在轉(zhuǎn)膜夾上按順序放上海綿2層，濾紙3層，SDS-PAGE凝膠，NC膜，濾紙3層，將其移入含有轉(zhuǎn)膜液的轉(zhuǎn)膜槽中;接通電源，350mA恒流跑90分鐘。⑤封閉：將NC膜取出放入封閉液中，搖床封閉1小時(shí)，封閉結(jié)束后在TBST液中清洗25分鐘。⑥孵育一抗：將NC膜按照所需的目的蛋白的分子量進(jìn)行裁剪;剪好的條帶放入到用5%BSA稀釋過(guò)的一抗中，放入冰柜中低溫?fù)u床過(guò)夜。⑦孵育二抗：取出抗體中的條帶，在TBST液中漂洗3遍，每遍15分鐘;接著放入稀釋后的二抗中，室溫下?lián)u床孵育2小時(shí);孵育結(jié)束之后，重復(fù)上面步驟。⑧曝光：按照A：B=1：1提前配制好ECL發(fā)光劑，避光保存;將條帶放進(jìn)超敏化學(xué)反應(yīng)儀中，加上發(fā)光劑，進(jìn)行曝光。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析;各指標(biāo)間相關(guān)采用Person相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)分析用GraphPad Prism 5和SPSS 20.0軟件處理，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清總膽固醇（TC）指標(biāo)

與普食對(duì)照組相比，高脂對(duì)照組的TC值顯著升高（P<0.05），并且超過(guò)正常范圍的參考值;與飲食限制組相比，高脂對(duì)照組的TC值顯著升高（P<0.05）;飲食限制組的TC值較普食對(duì)照組有升高趨勢(shì)（P>0.05）。

3.2血清肌酸激酶（CK）活性測(cè)試

高脂對(duì)照組和飲食限制組的CK值較普食對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與飲食限制組相比，高脂對(duì)照組的CK值有升高的趨勢(shì)，但是差異不具有顯著性（P>0.05）。

3.3 Western blot檢測(cè)ALDH2的蛋白表達(dá)

高脂對(duì)照組ALDH2表達(dá)較普食對(duì)照組顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高脂對(duì)照組ALDH2表達(dá)較飲食限制組明顯降低，差異具有顯著性（P<0.05）;飲食限制組ALDH2表達(dá)較普食對(duì)照組有下降趨勢(shì)，但是差異沒(méi)有顯著性（P>0.05）。

3.4指標(biāo)間相關(guān)分析

TC和CK指標(biāo)之間具有相關(guān)性（P<0.05）;TC和ALDH2指標(biāo)之間具有相關(guān)性（P<0.05）;CK和ALDH2指標(biāo)之間具有相關(guān)性（P<0.05）。

4 討論與分析

4.1 高脂飲食對(duì)大鼠總膽固醇和肌酸激酶水平的影響

本實(shí)驗(yàn)主要的研究目的是探討高脂飲食對(duì)肥胖大鼠心肌中ALDH2表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂對(duì)照組的TC值顯著高于普食對(duì)照組，并且超過(guò)正常范圍的參考值，而飲食限制組后四周改用標(biāo)準(zhǔn)飼料后，TC值相較于高脂對(duì)照組來(lái)說(shuō)顯著降低，證明八周的高脂飲食使得大鼠血清中TC水平升高，對(duì)大鼠進(jìn)行飲食控制后體內(nèi)的TC水平下降。在大鼠CK的活性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，高脂對(duì)照組和飲食限制組的CK值較普食對(duì)照組均顯著升高，而且高脂對(duì)照組的CK值較飲食限制組有升高趨勢(shì)。研究顯示在心肌損傷中，細(xì)胞會(huì)釋放多種酶，尤其是CK。雖然并不能完全通過(guò)CK值驗(yàn)證是否造成了心肌的損傷，我們可以在一定程度上推測(cè)心肌受損的發(fā)生。通過(guò)TC值和CK活性的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，可以驗(yàn)證高脂飲食使大鼠體內(nèi)的總膽固醇和肌酸激酶水平升高，長(zhǎng)期進(jìn)食高脂食物增加了心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。

4.2 乙醛脫氫酶2（ALDH2）對(duì)心肌的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白印跡免疫法檢測(cè)高脂大鼠ALDH2蛋白的表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)高脂對(duì)照組的ALDH2蛋白表達(dá)較普食對(duì)照組來(lái)說(shuō)顯著降低;與高脂對(duì)照組相比，飲食限制組的ALDH2蛋白表達(dá)則有顯著提高，結(jié)果提示由高脂造成的心臟功能受損與ALDH2的表達(dá)下降有關(guān)，ALDH2表達(dá)增加有保護(hù)心肌，降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的作用。本實(shí)驗(yàn)選擇ALDH2 作為高脂飲食對(duì)心肌影響的研究點(diǎn)，是因?yàn)锳LDH2已經(jīng)成為當(dāng)前研究和治療高脂血癥和相關(guān)心血管疾病的重要方向。

據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織的報(bào)告顯示缺血性心臟病是占據(jù)首位的死亡原因，而我國(guó)的心血管病發(fā)病人數(shù)在2018年達(dá)到2.9億。飲酒，高脂和高糖的飲食方式會(huì)刺激心血管，誘發(fā)病變的發(fā)生。乙醛脫氫酶2（ALDH2）是線粒體內(nèi)重要的醛類氧化酶，它參與了4-HNE的代謝過(guò)程。而4-HNE是醛類中主要的代謝產(chǎn)物，毒性很高，在心肌缺血損傷中，氧自由基增加，細(xì)胞內(nèi)的非飽和脂質(zhì)被氧化，釋放大量的有毒醛類物質(zhì)，大量毒醛類物質(zhì)的堆積，會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成很強(qiáng)的毒性作用，因此以ALDH2參與4-HNE為切入點(diǎn)，揭開(kāi)了它對(duì)于心肌的保護(hù)作用。酒精的大量攝入會(huì)使心功能降低，從而造成心肌損傷。山東大學(xué)的研究指出，乙醛脫氫酶2通過(guò)抑制p38MAPK/CREB通路的激活，從而抑制心肌中血管緊張素原和血管緊張素Ⅱ的升高，最終改善酒精引起的心肌損傷[6]。最近實(shí)驗(yàn)表明ALDH2通過(guò)調(diào)節(jié)自噬水平，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)、功能密切來(lái)保護(hù)心肌[3]。有研究證實(shí)了在心功能衰竭的線粒體中ALDH2低表達(dá)，心功能衰竭后心肌梗死時(shí)間越長(zhǎng)，ALDH2的水平就越低，提示ALDH2具有保護(hù)心臟的作用。還有實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)染法使ALDH2的基因高表達(dá)，結(jié)果顯示心肌梗死受損面積減少了47%。目前阿爾達(dá)（alda-1）被認(rèn)為是ALDH2的激動(dòng)劑，它能夠加快乙醛代謝，提高ALDH2的活性，增加ALDH2的表達(dá)，可以有效防止冠心病的發(fā)生，并且增加ALDH2的活性可以減少缺血再灌注后心肌梗死的面積[4]。有研究報(bào)道ALDH2rs671位點(diǎn)突變的人群具有更高的心血管事件的發(fā)生率，但是具體的分子機(jī)制尚不清楚。Shanshan Zhong等研究發(fā)現(xiàn)，乙醛脫氫酶2通過(guò)與低密度脂蛋白受體（LDLR）和AMPK相互作用，調(diào)控泡沫細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。實(shí)驗(yàn)可知，雙敲出ALDH2/LDLR的小鼠比敲出LDLR的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊明顯減少[5]?？梢?jiàn)ALDH2的表達(dá)和活性與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。

4.3 展望與建議

隨著生活水平的提高，人們的飲食方式發(fā)生著變化，致使心血管疾病的發(fā)病率不斷升高。本文僅就高脂飲食一個(gè)致病因素作為研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，飲食限制組大鼠的TC值較高脂對(duì)照組顯著下降，并且CK活性較高脂對(duì)照組也有下降的趨勢(shì)，證明限制高脂飲食可以降低心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，因此飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整尤為重要。人們應(yīng)按照膳食結(jié)構(gòu)合理的安排一日三餐，要多吃植物油，減少動(dòng)物油的攝入。每天脂肪的攝入量在50克左右為宜，保證不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例>1.5。限制富含膽固醇多的食物，可以多吃洋蔥，大蒜，香菇之類的可以降低膽固醇的食物。以谷物為主;多吃新鮮的瓜果蔬菜，保證各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均衡攝取。清淡飲食，少鹽少油。限制飲酒量，研究顯示適量飲酒可以提高ALDH2的活性，保護(hù)心臟，過(guò)度的飲酒則會(huì)增加高血壓，心力衰竭，腦猝死的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，積極參加體育運(yùn)動(dòng)，已有研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)可以預(yù)防心血管疾病的發(fā)生并改善疾病程度。本研究通過(guò)總膽固醇和肌酸激酶兩個(gè)指標(biāo)判斷心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，仍需要結(jié)合病理形態(tài)學(xué)觀察。證實(shí)高脂飲食的攝入使得心肌乙醛脫氫酶2表達(dá)下降，但是具體的調(diào)控其蛋白表達(dá)的分子信號(hào)通路不清楚。

5 結(jié)論

八周高脂飲食可引起大鼠血清中總膽固醇和肌酸激酶的水平升高，心肌ALDH2蛋白表達(dá)下降，提示心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加。盡早調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)，減少高脂食物的攝入，可以降低血清總膽固醇水平，增加心肌ALDH2蛋白表達(dá)，從而降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。

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