不同炮制方法對(duì)林蛙油質(zhì)量的影響

徐 陽，單柏宇，馬玉蓮，房 闊，鮑慧瑋

(1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)與食品學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130031；2.白城市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林白城137000；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130117)

林蛙油，又稱哈蟆油，是中國(guó)林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)中雌性林蛙的輸卵管干燥形成的脂肪狀物，具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤(rùn)肺的功效[1]。隨著全民健身意識(shí)的提升，目前林蛙油常常作為一種較名貴的“滋補(bǔ)佳品”流通，食用方法也由原來單一的傳統(tǒng)沖泡法衍變出多種烹飪及處理方法[2-3]。

對(duì)于中藥林蛙油來說，僅依靠幾種化學(xué)成分含量很難全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量，總醇提物含量、脂溶性成分含量和酸值無疑是油脂類物質(zhì)的評(píng)價(jià)依據(jù)，而作為主要活性成分之一的水溶性蛋白，也是衡量指標(biāo)之一[4-7]。本文利用7種不同的炮制方法處理林蛙油，通過對(duì)其總醇提物、脂溶性成分、酸值和水溶性蛋白的測(cè)定，綜合比較不同炮制方法對(duì)林蛙油質(zhì)量的影響，為林蛙油的進(jìn)一步市場(chǎng)開發(fā)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

TU1810型紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；AB135-S型分析天平(澳大利亞梅特勒公司)；FA1004B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)。

林蛙油(吉林省鼎源特產(chǎn)經(jīng)貿(mào)有限公司，批號(hào)：20170801)，經(jīng)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室肖井雷副教授鑒定為正品，符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版一部)項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定。

牛血清白蛋白對(duì)照品(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：605U056)；硫酸銅、氫氧化鈉、碘化鉀、酒石酸鉀鈉、石油醚(沸程60～90℃)、無水乙醇、酚酞試液、乙醚，均為分析純，購(gòu)于北京化工廠。

1.2 不同林蛙油炮制方法

清炒：取林蛙油適量，粉碎，文火加熱至褐色，取出，放涼。

酒炙：取林蛙油適量，粉碎，加十分之一的量的黃酒拌勻，悶透，用文火炒至焦褐色，取出，放涼。

炒炭：取林蛙油適量，粉碎，置熱鍋內(nèi)，用武火炒至焦黑色，噴淋清水少許，取出，晾干。

煮制：取林蛙油適量，粉碎，加8倍水煮30 min，取出，干燥。

燉制：取林蛙油適量，粉碎，加入20%的量的水，燉至水完全被吸盡時(shí)，放涼，取出，干燥。

烘干(40℃)：取林蛙油適量，粉碎，置40℃烘箱中烘干4 h，取出，晾干。

烘干(100℃)：取林蛙油適量，粉碎，置100℃烘箱中烘干4 h，取出，晾干。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同炮制方法的林蛙油總醇提物的測(cè)定

稱取不同林蛙油炮制品各10 g，加8倍無水乙醇，80℃水浴回流提取2次，每次30 min，過濾，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中并干燥至恒重。按照公式(1)，計(jì)算各供試品中總醇提物的含量，結(jié)果見表1。

(1)

其中，w1為總醇提物的含量，A1為干燥后供試品和容器的質(zhì)量(g)，A2為容器的質(zhì)量(g)，W為加入供試品的總質(zhì)量(g)。

表1 不同炮制方法的林蛙油總醇提物含量測(cè)定結(jié)果

2.2 不同炮制方法的林蛙油脂溶性成分的測(cè)定

稱取不同林蛙油炮制品各10 g，加8倍石油醚，75℃水浴回流提取2次，每次30 min，過濾，分別收集藥渣和濾液，藥渣備用，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中并干燥至恒重[8]。按照公式(2)，計(jì)算各供試品中脂溶性成分的含量，結(jié)果見表2。

(2)

其中,w2為脂溶性成分的含量，A1為干燥后供試品和容器的質(zhì)量(g),A2為容器的質(zhì)量(g),W為加入供試品的總質(zhì)量(g)。

表2 不同炮制方法的林蛙油脂溶性成分含量測(cè)定結(jié)果

2.3 不同炮制方法的林蛙油酸值的測(cè)定

取“2.2”提取并稱定質(zhì)量的石油醚提取物，加乙醇-乙醚(1∶1)混合液5 mL，臨用前加酚酞指示液0.1 mL，用NaOH滴定液(0.1 mol/L)，調(diào)至微顯粉紅色，振搖使其完全溶解，用NaOH滴定液(0.1 mol/L)滴定至粉紅色，持續(xù)30 s不褪色[9]。按照公式(3)，計(jì)算各供試品的酸值，結(jié)果見表3。

(3)

其中，x為供試品的酸值，A為消耗氫氧化鈉滴定液的體積(mL)，W為加入供試品的總質(zhì)量(g)。

2.4 雙縮脲法測(cè)定林蛙油不同炮制品中水溶性蛋白含量

2.4.1 雙縮脲試液的配制

取硫酸銅1.5 g、酒石酸鉀鈉6.0 g和碘化鉀5.0 g，加水500 mL溶解，邊攪拌邊加入10%氫氧化鈉溶液300 mL，用水稀釋至1000 mL，混勻，即得。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取牛血清白蛋白對(duì)照品適量，加水溶解并制成濃度為10 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

稱取“2.2”保存的未炮制哈蟆油濾渣0.1 g，加pH為12的氫氧化鈉溶液5 mL，混勻，渦旋混合3 min，靜置30 min，加20 mL雙縮脲試液，反復(fù)倒置10次混勻，靜置30 min，再次搖勻，2000 r/min離心2 min，取上清液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0 mL，再分別加入雙縮脲試液4.0 mL，立即混勻，室溫放置30 min，依照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版四部)紫外-可見分光光度法(通則0401)，在540 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[10-11]；同時(shí)以0號(hào)管作為空白。以吸光度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。得到的線性回歸方程為y=0.0258x-0.0019(R2=0.9985)，線性范圍為0～10 mg/mL(圖1)。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.5 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液6份，在540 nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果水溶性蛋白吸光度的RSD為1.91%，說明該方法的精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品適量，精密稱取6份，按“2.4.3”制備供試品溶液，在540 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定。結(jié)果水溶性蛋白的平均含量為39.28%、RSD為1.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、10 h在540 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定，結(jié)果水溶性蛋白吸光度的RSD為1.53%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的供試品粉末6份，每份約0.05 g，加入對(duì)照品溶液2 mL，再加入pH為12的氫氧化鈉溶液3 mL，繼續(xù)按“2.4.3”制備供試品溶液，在540 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率結(jié)果

2.4.9 樣品測(cè)定

取“2.2”保存的各炮制品濾渣，每種樣品稱取5份，每份約0.1 g，按“2.4.3”制備供試品溶液，在540 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定，計(jì)算平均水溶性蛋白含量,結(jié)果見表5。

表5 不同炮制方法的林蛙油中水溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

林蛙油為油脂狀物，總醇提物含量和脂溶性成分含量測(cè)定是指分別用不同的溶劑對(duì)藥材中的可溶性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，以其含量的高低評(píng)價(jià)藥材的品質(zhì)。本文對(duì)7種不同炮制方法處理的炮制品進(jìn)行測(cè)定，烘干(40℃和100℃)、煮制、燉制與未炮制林蛙油的總醇提物含量接近，說明烘干(40℃和100℃)、煮制、燉制對(duì)總醇提取物的影響較小，酒炙、清炒和炒炭對(duì)總醇提物的影響較大，大量的化合物已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成新的化合物，藥效方面可能會(huì)有較大差異；脂溶性成分是重要的功能營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)抗疲勞和增強(qiáng)免疫力等方面均有重要作用，隨著炮制所用溫度的升高，脂溶性化合物的含量也隨之下降，溫度可破壞脂肪酸類成分。其中被破壞程度：燉制>酒炙>煮制>炒炭>烘干(100℃)>清炒>烘干(40℃)>未炮制。

酸值表現(xiàn)林蛙油中游離脂肪類成分的含量，游離脂肪酸類化合物對(duì)于人體具有重要的生理活性，是林蛙油中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分之一，通過實(shí)驗(yàn)表明，煎制和燉制的方法使林蛙油中大量的脂肪酸類成分降低，而通過炒炭方法使其生成大量新的游離脂肪酸，使之含量有明顯的升高。酒炙、烘干(40℃和100℃)能較好地保留脂肪酸類成分。

林蛙油主要成份是蛋白質(zhì)[12-13]，本文參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則 0713脂肪與脂肪油測(cè)定法第三法——雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得水溶性蛋白含量：未炮制>烘干(40℃)>酒炙>烘干(100℃)>煮制>燉制>清炒>炒炭，不同炮制和加工方法均使水溶性蛋白成分有所降低，其中烘干40℃降低最少，和未炮制林蛙油幾乎相當(dāng)，可以較好地保護(hù)蛋白質(zhì)類成分。其中高溫炒炭降低最多，說明長(zhǎng)時(shí)間和高溫加熱會(huì)破壞林蛙油中水溶性蛋白成分，故建議低溫炮制和加工，保留林蛙油水溶性蛋白類成分。

綜合來看，烘干(40℃和100℃)、酒炙、燉制、煮制、炒炭和清炒均對(duì)林蛙油中總醇提物、脂溶性成分、脂肪酸類化合物和蛋白質(zhì)類化合物具有一定的影響，其中低溫烘干的加工方式對(duì)林蛙油藥效成分的保留有較好作用，而清炒和炒炭對(duì)各類成分破壞較大。溫度和受熱時(shí)間對(duì)林蛙油各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響較大，食用和加工林蛙油時(shí)，建議控制加熱溫度和時(shí)間。