UPLC-DAD法同時測定不同干燥工藝三白草中5種黃酮成分的含量

孫冬梅，段福先，江潔怡,廖小芳，香志豪，李素梅

(1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院(廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點研究室)，廣東 廣州 510095; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 520405)

三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.是傳統(tǒng)中藥，最早記錄于《本草經(jīng)集注》，分布于河北、河南、山東和長江流域及其以南各地，生于低濕溝邊、塘邊或溪旁[1]。研究報道，三白草藥材含有揮發(fā)油、黃酮、木脂素、生物堿、鞣質(zhì)等成分[2]，并具有廣泛的藥理作用。三白草中黃酮類化合物具有很好的抗氧化作用[3]，其中的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素具有多種生物活性[4]。通過對三白草的地上部分進(jìn)行活性檢測，發(fā)現(xiàn)其中3個黃酮醇化合物具清除自由基的活性[5]；蘆丁具有清除自由基、促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長、降低血糖、抑制結(jié)腸癌和前列腺癌等作用[6]；金絲桃苷具有明顯的抗感染作用[6]；槲皮素和槲皮苷具有抑制葡萄糖和半乳糖還原成相應(yīng)的多元醇的作用，在阻止由糖尿病引起的白內(nèi)障、神經(jīng)病和血管類疾病的發(fā)生發(fā)揮重要作用[7]。

越來越多的研究報道，干燥加工過程不僅是促使藥用部位所含水分減失至有利于運輸、貯藏，更為重要的是干燥過程，也是中藥材及中藥飲片藥性形成的重要環(huán)節(jié)[8-10]。本文研究了烘箱30 ℃干燥、烘箱60 ℃干燥、真空冷凍干燥3種干燥工藝對三白草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素等5種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，為改進(jìn)三白草的初加工及三白草的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器(美國)；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TLE204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-6恒溫水浴鍋(北京精科華瑞有限公司)；CIENTZ-30F冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；ALB-200高速多功能粉碎機(jī)(上海塞耐機(jī)械有限公司)；Milli Pore Advantage A10自動純水機(jī)(美國)。

金絲桃苷對照品(批號：111521-201205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：93.3%)、蘆丁對照品(批號：100080-201409，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：92.6%)、槲皮苷對照品(批號：111538-200504，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%)、槲皮素對照品(批號：0081-9034，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.8%)購自中國食品藥品檢定研究院；異槲皮苷對照品(批號：482-35-9，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.6%)購自成都埃法生物科技有限公司；甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司)；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。

3批三白草藥材(編號：S1，產(chǎn)地：廣東梅州；編號：S2，產(chǎn)地：廣西玉林；編號：S3，產(chǎn)地：廣東江門)，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦教授鑒定為三白草科植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.。分別將同一批新鮮三白草藥材取地上部分，洗凈，晾干，剪碎，平均分成3份，分別用冷凍干燥機(jī)真空冷凍干燥、烘箱30 ℃干燥和烘箱60 ℃烘干方法進(jìn)行干燥，至含水量≤13%。再由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過四號篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～13%A；5～12 min，13%～16%A；18～28 min，16%～30%A；28～30 min，30%～100%A)；柱溫：25 ℃；流速：0.2 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素適量，精密稱定，用甲醇制成每1 mL分別含蘆丁70.58 μg、金絲桃苷60.87 μg、異槲皮苷76.14 μg、槲皮苷75.43 μg、槲皮素19.96 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取三白草樣品粉末(過4號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白樣品溶液的制備 取80%甲醇1 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗與專屬性試驗

分別取混合對照品溶液、供試品溶液、空白樣品溶液各2 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。可見，空白對照色譜圖中在與對照品色譜圖相應(yīng)的位置上無對應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，表明方法專屬性良好。

100806040200100806040200100806040200mAUmAUmAU1234512345051015202530t/minABC

1.蘆??； 2.金絲桃苷； 3.異槲皮苷； 4.槲皮苷； 5.槲皮素；A.三白草黃酮混合對照品； B.三白草樣品； C.空白樣品。

圖1超高效液相色譜圖
Figure1UPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取混合對照品溶液0.1、1、2、4、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、各峰面積值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，5種成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1?？梢姡?種成分在其相應(yīng)線性范圍內(nèi)均有良好相關(guān)性。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液(編號S1，60 ℃烘箱干燥)2 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的峰面積RSD值分別為0.48%、0.31%、0.30%、0.31%、0.55%(n=6)，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(編號S1，60 ℃烘箱干燥)，分別在0、2、4、8、12、24 h各進(jìn)樣1次，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD值分別為0.52%、0.94%、0.58%、1.45%、1.36%，均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品(編號S1，60 ℃烘箱干燥)，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2. 1”項下色譜條件下分別進(jìn)樣，測定峰面積并計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.65%、1.54%、0.78%、1.61%、1.19%，均小于2%，表明方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)同一批次的三白草樣品(編號S1，60 ℃烘箱干燥)6份，研細(xì)，每份0.5 g，精密稱定，加入一定量的對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表1 5種黃酮成分線性關(guān)系的考察結(jié)果Table 1 Results of the linear relationship of the five components

2.9 三白草中黃酮類成分的測定

取不同干燥方法制備的三白草樣品(四號篩)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，并按外標(biāo)法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3?？梢?，不同干燥條件下，3批三白草藥材5種黃酮類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定的差異，從大到小的順序為：烘箱30 ℃干燥>真空冷凍干燥>烘箱60 ℃干燥，烘箱30 ℃干燥對黃酮成分的保留效率最高。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 The results of the recovery test

表3 不同干燥方式下三白草黃酮類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 The contents of flavonoid in Saururus chinensis (Lour.) Baill. by different drying methods (n=2) w/(mg·g-1)

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

分別考察了不同的提取溶劑(甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇)、提取方法(回流、超聲)、提取時間(15、30、45 min)對三白草中5種成分提取效果的影響，結(jié)果顯示回流 30 min時，80%甲醇回流提取效果最佳。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

通過DAD檢測器對供試品色譜在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，綜合考慮5種成分，最終選擇 254 nm 作為該方法的檢測波長。

比較乙腈-水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%H3PO4、乙腈-0.1%甲酸溶液等不同洗脫系統(tǒng)對分離效果的影響，結(jié)果表明以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相時，色譜中各待測成分均能達(dá)到很好的分離效果，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為洗脫流動相。

分別比較了柱溫為 20、25、30 ℃，流速分別為0.1 mL/min和0.2 mL/min對色譜分離效果的影響，結(jié)果表明柱溫為 20 ℃、流速為0.2 mL/min時，分離效果比較好。

共考察了3種不同品牌的色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)、Advance Bio Petide plus(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)、ACQUITY UPLC BRH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)的分離效果，結(jié)果顯示只有Waters CORTECS UPLC C18柱能將金絲桃苷和異槲皮苷的色譜峰分開，因此，選擇該色譜柱。

3.3 不同干燥方式的干燥時間比較

烘箱30 ℃干燥對新鮮三白草藥材的烘干時間最長，但加工工藝簡單，成本較低；真空冷凍干燥耗時長，且對設(shè)備要求高、耗能大，不適合批量處理；60 ℃烘箱干燥效率高，溫度可控，處理量大，適用于大多數(shù)中藥材的干燥加工。但本文研究結(jié)果顯示，60 ℃烘箱干燥對三白草黃酮類成分的保留率較低，不建議采用60 ℃烘箱干燥法對三白草進(jìn)行干燥。

3.4 不同干燥方法對三白草黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

不同干燥條件下，三白草中黃酮成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)從大到小的排列順序是烘箱30 ℃干燥>真空冷凍干燥>烘箱60 ℃干燥，在烘箱30 ℃干燥條件下，三白草藥材中黃酮成分保留較好。

本研究建立的UPLC法同時測定三白草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)方法快速、簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于控制三白草的質(zhì)量。不同干燥工藝的黃酮成分保留以烘箱30 ℃干燥為最佳，為三白草的初加工及開發(fā)利用提供參考。