綠獨(dú)籽藤葉的化學(xué)成分研究

朱彩燕，楊玉瑩，廖華衛(wèi)，王定勇，黃曉明

(1.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510655; 2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006; 3.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006; 4.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510655)

綠獨(dú)子藤[Celastrusvirens(F.T.Wang & T.Tang) C.Y.Cheng & T.C.Kao]為衛(wèi)矛科(Celastraceae)南蛇藤屬(Celastrus)植物，主要分布于我國(guó)云南、廣西、廣東等省區(qū)的山谷叢林之中。南蛇藤屬植物已有15種入藥，多數(shù)具有袪風(fēng)除濕、消腫解毒、行氣散血等功效，民間常用于治療風(fēng)濕筋骨疼痛、跌打損傷等病癥[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，該屬植物具有殺菌、殺蟲、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等藥理活性[2]。本課題組已對(duì)同屬植物南蛇藤(Celastrusorbiculatus)、獨(dú)子藤(Celastrusmonospermus)、綠獨(dú)籽藤(Celastrusvirens)根皮進(jìn)行了較系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，獲得了一系列結(jié)構(gòu)獨(dú)特的木栓烷型三萜類化合物[3-5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，木栓烷型三萜類化學(xué)成分具有抗腫瘤、免疫抑制、抗?jié)?、抗艾滋病毒、減肥等多種生物活性[6-7]。

為了尋找更多的具有生物活性的木栓烷型三萜類化學(xué)成分，以及為該類成分的構(gòu)效關(guān)系研究提供更多化學(xué)實(shí)體，本研究對(duì)綠獨(dú)籽藤葉子的體外抗腫瘤活性部位-三氯甲烷萃取物(對(duì)肺癌A549細(xì)胞株IC50為38.0 μg/mL)進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，共分離鑒定了10個(gè)化合物，分別為二十二酸(1)、β-谷甾醇(2)、豆甾醇(3)、齊墩果烯(4)、木栓烷酮(5)、3-氧代-11β-羥基木栓烷(6)、3，12-二氧代-28-羥基木栓烷(7)、3-氧代木栓烷-28-醛(8)、3-氧代-12α-羥基木栓烷(9)、3-氧代-12α，28-二羥基木栓烷(10)，其中木栓烷型三萜6個(gè)(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)，現(xiàn)報(bào)道如下。

圖1化合物5～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
Figure1Struture of compounds5-10

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

綠獨(dú)籽藤葉子于2017年10月采自廣東省陽(yáng)春市，由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院曾令杰博士鑒定為綠獨(dú)籽藤(Celastrusvirens)的葉子，樣品保存在廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室(標(biāo)本號(hào)：No.20171015)；薄層色譜用硅膠(H、G、GF254)和柱層析硅膠(100～200目、200～300目)均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、甲醇(分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.2 儀器

Agilent 6120型質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；Avance Ⅲ500MHz核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司，TMS為內(nèi)標(biāo))；Tensor-27傅立葉變換紅外光譜儀(瑞士Bruker公司，KBr壓片)；X-6型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(南京內(nèi)馬儀器設(shè)備有限公司，溫度未校正)。

2 提取與分離

5.0 kg綠獨(dú)籽藤葉子陰干、粉碎后，用60 L甲醇回流提取3次，每次用甲醇20 L，提取液合并后減壓濃縮得總浸膏105.5 g。浸膏分散在1 500 mL蒸餾水中，加少量甲醇助溶后置于5 000 mL分液漏斗中，依次用石油醚(60～90 ℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，65 ℃下減壓濃縮各萃取液，分別得石油醚萃取物浸膏(10.0 g)、三氯甲烷萃取物浸膏(25.0 g)、乙酸乙酯萃取物浸膏(34.5 g)、正丁醇萃取物浸膏(20.1 g)?？拱┗钚院Y選結(jié)果顯示，三氯甲烷萃取物浸膏有較好的抗癌活性(對(duì)肺癌A549細(xì)胞株IC50為38.0 μg/mL，擬另文報(bào)道)。

三氯甲烷萃取物浸膏(25.0 g)經(jīng)硅膠(100～200目)柱層析(800 g，60 mm×1 000 mm)，石油醚-乙酸乙酯(體積比10∶1、5∶1、1∶1、0.5∶1)洗脫，減壓濃縮，分別得到4個(gè)洗脫組分：第1組分(2.5 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析，石油醚-乙酸乙酯(體積比20∶1～5∶1)梯度洗脫，同時(shí)配合重結(jié)晶技術(shù)，獲得化合物1(15.0 mg)、2(25.2 mg)和3(18.0 mg)；第2組分(4.8 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析，石油醚-乙酸乙酯(體積比10∶1～1∶1)梯度洗脫，同時(shí)配合重結(jié)晶技術(shù)，獲得化合物4(35.0 mg)和5(48.3 mg)；第3組分(2.5 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析，石油醚-乙酸乙酯(體積比5∶1～0.5∶1)梯度洗脫，同時(shí)配合重結(jié)晶和制備薄層技術(shù)，獲得化合物6(15.8 mg)、8(20.7 mg)和9(18.5 mg)；第4組分(5.0 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析，石油醚-丙酮(體積比10∶1～1∶1)梯度洗脫，同時(shí)配合重結(jié)晶和制備薄層技術(shù)，獲得化合物7(25.0 mg)和10(38.3 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色顆粒狀晶體(石油醚-乙酸乙酯)，mp 79.5～80.5 ℃；ESI-MS:m/z339.2 [M-H]-；IR(KBr)νmax/cm-1:2 956，2 918，2 850，1 706，1 473，1 464，1 295，936，720；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.87(3H，t，J=7.0 Hz)，1.23(36H，m)，1.61(2H，m)，2.33(2H，t，J=7.5 Hz)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：14.3(C-22)，22.9-34.2(C-20至C-2)，180.2(—COOH)。根據(jù)上述數(shù)據(jù)，鑒定化合物1為二十二酸(behenic acid)。

化合物2：白色針狀晶體(三氯甲烷)，mp 139.5～141.0 ℃；與β-谷甾醇對(duì)照品共薄層色譜檢測(cè)，Rf值一致；混和熔點(diǎn)測(cè)定，溫度不下降。鑒定化合物2為β-谷甾醇(β-sitosterol)。

化合物3：白色針狀晶體(三氯甲烷)，mp 170.0～171.5 ℃；與豆甾醇對(duì)照品共薄層色譜檢測(cè)，Rf值一致；混和熔點(diǎn)測(cè)定，溫度不下降。鑒定化合物3為豆甾醇(stigmasterol)。

化合物4：無(wú)色針狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp 173.5～175.0 ℃；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.17(1H，m，H-12)，3.20(1H，m，3-H)，1.13(3H，s，27-Me)，1.01(3H，s，26-Me)，0.98(3H，s，25-Me)，0.95(3H，s，23-Me)，0.86(6H，s，29，30-Me)，0.82(3H，s，28-Me)，0.79(3H，s，24-Me)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：38.6(C-1)，27.1(C-2)，79.0(C-3)，38.7(C-4)，55.4(C-5)，18.4(C-6)，32.7(C-7)，39.8(C-8)，47.5(C-9)，37.0(C-10)，23.5(C-11)，121.5(C-12)，145.1(C-13)，41.6(C-14)，28.5(C-15)，26.2(C-16)，32.5(C-17)，47.2(C-18)，46.8(C-19)，31.2(C-20)，34.7(C-21)，37.1(C-22)，28.1(C-23)，15.7(C-24)，15.5(C-25)，16.8(C-26)，26.1(C-27)，27.3(C-28)，33.5(C-29)，23.6(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物4為齊墩果烯(oleanene)。

化合物5：無(wú)色針狀結(jié)晶(三氯甲烷)，mp 230.1～231.5 ℃；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：2.41(1H，m)，2.24(1H，q)，2.24(1H，q)，1.97(1H，m)，1.74(1H，m)，1.70(1H，m)，1.18(3H，s，28-Me)，1.06(3H，s，27-Me)，1.02(3H，s，26-Me)，1.00(3H，s，29-Me)，0.94(3H，s，30-Me)，0.88(3H，d，J=6.5 Hz，23-Me)，0.87(3H，s，25-Me)，0.70(3H，s，24-Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：22.4(C-1)，41.6(C-2)，213.1(C-3)，58.0(C-4)，42.2(C-5)，41.3(C-6)，18.1(C-7)，53.2(C-8)，37.5(C-9)，59.6(C-10)，35.7(C-11)，30.5(C-12)，39.6(C-13)，38.4(C-14)，32.4(C-15)，36.1(C-16)，30.1(C-17)，42.8(C-18)，35.5(C-19)，28.2(C-20)，32.7(C-21)，39.4(C-22)，6.7(C-23)，14.6(C-24)，17.9(C-25)，18.8(C-26)，20.3(C-27)，32.0(C-28)，31.7(C-29)，35.1(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物5為木栓烷酮(3-oxo-friedelane)。

化合物6：無(wú)色針狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp 258.6～259.9 ℃；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.66(1H，dd)，2.80(1H，m)，2.36(1H，m)，2.37(1H，m)，2.26(1H，q)，1.19(3H，s，28-Me)，1.10(3H，s，27-Me)，1.01(3H，s，26-Me)，1.00(3H，s，29-Me)，0.95(3H，s，30-Me)，0.92(3H，s，25-Me)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，23-Me)，0.74(3H，s，24-Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：25.1(C-1)，41.6(C-2)，213.5(C-3)，58.2(C-4)，43.2(C-5)，42.2(C-6)，18.0(C-7)，52.7(C-8)，44.1(C-9)，60.0(C-10)，76.9(C-11)，42.1(C-12)，41.2(C-13)，38.1(C-14)，32.5(C-15)，35.9(C-16)，30.1(C-17)，42.5(C-18)，35.5(C-19)，28.0(C-20)，32.7(C-21)，39.1(C-22)，6.8(C-23)，14.8(C-24)，12.9(C-25)，20.2(C-26)，19.6(C-27)，32.1(C-28)，31.8(C-29)，35.1(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物6為3-氧代-11β-羥基木栓烷(3-oxo-11β-hydroxyfriedelane)。

化合物7：無(wú)色針狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp 295.5～297.0 ℃；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.67(1H，d，J=11 Hz)，3.55(1H，d，J=11 Hz)，2.66(1H，d，J=11.5 Hz)，2.40(1H，m)，2.31(1H，m)，2.28(1H，q)，2.03(1H，m)，2.01(1H，m)，1.99(1H，m)，1.91(1H，m)，1.05(3H，s，27-Me)，0.99(3H，s，26-Me)，0.94(3H，s，29-Me)，0.91(3H，d，J=6.5 Hz，23-Me)，0.88(3H，s，30-Me)，0.85(3H，s，25-Me)，0.72(3H，s，24-Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：22.2(C-1)，41.0(C-2)，212.1(C-3)，58.2(C-4)，42.0(C-5)，41.0(C-6)，18.6(C-7)，52.1(C-8)，44.4(C-9)，59.2(C-10)，51.1(C-11)，214.3(C-12)，55.7(C-13)，44.1(C-14)，30.0(C-15)，29.2(C-16)，34.6(C-17)，33.2(C-18)，33.5(C-19)，28.3(C-20)，36.1(C-21)，31.1(C-22)，6.9(C-23)，14.5(C-24)，18.4(C-25)，18.0(C-26)，19.7(C-27)，68.6(C-28)，33.4(C-29)，33.7(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物7為3，12-二氧代-28-羥基木栓烷(3,12-dioxo-28-hydroxyfriedelane)。

化合物8：無(wú)色針狀結(jié)晶(三氯甲烷)，mp 215.5～217.0 ℃；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.50(1H，s)，2.40(1H，m)，2.31(1H，m)，2.23(1H，q)，2.21(1H，m)，1.08(3H，s，27-Me)，0.98(3H，s，26-Me)，0.96(3H，s，29-Me)，0.87(3H，d，J=6.5 Hz，23-Me)，0.85(3H，s，30-Me)，0.72(3H，s，25-Me)，0.65(3H，s，24-Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：22.4(C-1)，41.4(C-2)，213.2(C-3)，58.2(C-4)，42.1(C-5)，41.1(C-6)，18.0(C-7)，52.8(C-8)，37.2(C-9)，59.3(C-10)，35.5(C-11)，30.6(C-12)，37.8(C-13)，38.7(C-14)，28.4(C-15)，32.5(C-16)，47.7(C-17)，36.4(C-18)，35.0(C-19)，33.5(C-20)，28.4(C-21)，32.4(C-22)，6.9(C-23)，14.6(C-24)，17.3(C-25)，18.8(C-26)，20.1(C-27)，20.9(C-28)，34.5(C-29)，39.6(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物8為3-氧代木栓烷-28-醛(3-oxo-friedelan-28-al)。

化合物9：無(wú)色針狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp 289.0～290.5 ℃；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.91(1H，dd，J=4.6，11.5 Hz)，2.41(1H，m)，2.28(1H，q)，2.25(1H，q)，1.96(1H，m)，1.91(1H，q)，1.81(1H，m)，1.77(1H，m)，1.75(1H，m)，1.69(1H，m)，1.66(1H，m)，1.60(1H，m)，1.21(3H，s，28-Me)，1.06(3H，s，27-Me)，1.04(3H，s，26-Me)，1.01(3H，s，29-Me)，0.96(6H，s，25，30-Me)，0.89(3H，d，J=6.5 Hz，23-Me)，0.75(3H，s，24-Me)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：22.1(C-1)，41.5(C-2)，212.7(C-3)，58.2(C-4)，42.0(C-5)，41.2(C-6)，18.0(C-7)，52.9(C-8)，38.1(C-9)，59.5(C-10)，47.4(C-11)，73.1(C-12)，45.2(C-13)，40.5(C-14)，33.6(C-15)，36.1(C-16)，30.7(C-17)，44.0(C-18)，38.7(C-19)，28.4(C-20)，32.5(C-21)，39.6(C-22)，6.9(C-23)，14.6(C-24)，19.5(C-25)，20.5(C-26)，11.5(C-27)，31.7(C-28)，35.0(C-29)，31.8(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物9為3-氧代-12α-羥基木栓烷(3-oxo-12α-hydroxy-friedelane)。

化合物10：無(wú)色針狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp 257.0～258.5 ℃；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ：3.88(1H，dd，J=4.6，11.2 Hz)，3.68(2H，s)，2.41(1H，m)，2.31(1H，m)，2.25(1H，q)，1.98(1H，m)，1.96(1H，m)，1.85(1H，m)，1.15(3H，s，27-Me)，1.00(3H，s，26-Me)，0.98(3H，s，29-Me)，0.97(3H，s，30-Me)，0.95(3H，s，25-Me)，0.89(3H，d，J= 6.5Hz，23-Me)，0.70(3H，s，24-Me)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：22.4(C-1)，41.4(C-2)，212.7(C-3)，58.1(C-4)，41.9(C-5)，41.2(C-6)，18.1(C-7)，52.1(C-8)，38.5(C-9)，59.4(C-10)，47.1(C-11)，73.0(C-12)，44.7(C-13)，40.6(C-14)，37.5(C-15)，32.0(C-16)，36.0(C-17)，40.4(C-18)，31.6(C-19)，28.3(C-20)，33.5(C-21)，29.3(C-22)，6.8(C-23)，14.7(C-24)，19.5(C-25)，19.1(C-26)，12.3(C-27)，67.8(C-28)，34.1(C-29)，33.0(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物10為3-氧代-12α，28-二羥基木栓烷(3-oxo-12α,28-dihydroxy-friedelane)。

4 結(jié)論

本研究共從綠獨(dú)子藤葉中獲得了10個(gè)單體化合物，其中6個(gè)為木栓烷型三萜，化合物1、2、3、6、7、8、10為首次從該植物中分離得到。根據(jù)本課題組已有的研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，木栓烷型三萜是南蛇藤屬植物的重要次生代謝產(chǎn)物，這類成分具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗風(fēng)濕等，本研究所獲得的6個(gè)木栓烷型三萜類成分抗腫瘤活性如何，是否為綠獨(dú)子藤葉子的抗腫瘤有效成分，相關(guān)工作還在進(jìn)一步研究當(dāng)中。