康柏西普對(duì)實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的作用機(jī)制研究

王爽 段素芳 牛秉軒 張軻 李曉鵬

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是異常的新生毛細(xì)血管[1]，這種異常的新生毛細(xì)血管來(lái)自眼球壁中層的脈絡(luò)膜。突破色素毛細(xì)血管層的基底膜通過(guò)破損處的Bruch膜進(jìn)入其視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)層下，同時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與RPE 之間易出血和滲出的異常新生血管是眼內(nèi)新生血管的主要表現(xiàn)形式之一[2]，也是年齡相關(guān)性黃斑變性[3]、病理性近視[4]、糖尿病黃斑水腫[5]、視網(wǎng)膜靜脈阻塞[6]、眼底血管樣條紋感染[7]等疾病發(fā)展的共同環(huán)節(jié)與特征?？蛋匚髌誟8]目前主要用于治療上述眼底新生血管形成疾病，同時(shí)對(duì)CNV也有一定的抑制作用?？蛋匚髌帐怯扇搜軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)中的免疫球蛋白樣區(qū)域2和人VEGF-2中的免疫球蛋白樣區(qū)域3、4及人免疫球蛋白IgG1的Fc片段融合而成。這種藥物可以特異結(jié)合VEGF-A、VEGF-B等，并通過(guò)阻斷由VEGF介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有效抑制病理性新生血管的生長(zhǎng)，且具有親和力強(qiáng)、作用時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)。本研究旨在研究康柏西普對(duì)實(shí)驗(yàn)性CNV的作用機(jī)制，從而為其治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取7周齡的雄性BN大鼠40只，體質(zhì)量(200±30)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022，普通級(jí)]，分8個(gè)籠子飼養(yǎng)，每個(gè)籠子5只。飼養(yǎng)于本院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑與儀器異硫氰酸熒光素購(gòu)自南京探求生物公司；注射用吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)購(gòu)自丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司；鹽酸氯胺酮注射液購(gòu)自建古田藥業(yè)有限公司；注射用鹽酸賽拉嗪購(gòu)自林華牧動(dòng)物保健品有限公司；多波長(zhǎng)氪激光機(jī)購(gòu)自上海昊量光電設(shè)備有限公司；吲哚菁綠血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)攝像機(jī)購(gòu)自億嘉博科創(chuàng)研究所；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立造模前給各組大鼠下肢肌肉注射35 mg·kg-1鹽酸氯胺酮和5 mg·kg-1鹽酸賽拉嗪混合麻醉液，使用復(fù)方托吡卡胺眼液散瞳，右眼前放置 120 D super field 前置鏡，找到視盤后，在一個(gè)視野下使用波長(zhǎng)為532 nm氪激光在視盤下方光凝2排，每排5個(gè)點(diǎn)，共10個(gè)點(diǎn)，激光時(shí)產(chǎn)生的氣泡提示激光點(diǎn)Bruch膜破裂，若該點(diǎn)出血或 Bruch膜未破裂則為無(wú)效點(diǎn)，每眼共光凝10個(gè)有效點(diǎn)。激光功率為150 mW，直徑為50 μm，曝光時(shí)間為0.1 s。造模成功標(biāo)準(zhǔn)參考李瑾等[9]研究。

1.2.2 分組及藥物干預(yù)將上述大鼠分為空白對(duì)照組、模型組、低劑量康柏西普組和高劑量康柏西普組；其中低量康柏西普組在造模成功后7 d、14 d在大鼠玻璃體內(nèi)注射康柏西普40 μL(10 g·L-1)；高劑量康柏西普組在造模成功后7 d、14 d在大鼠玻璃體內(nèi)注射康柏西普40 μL(20 g·L-1)；空白對(duì)照組和模型組分別注射等量生理鹽水。

1.2.3 檢測(cè)方法

1.2.3.1 CNV發(fā)生率及滲漏面積檢測(cè)造模后 21 d 對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉、散瞳，左眼拍攝眼底彩照。使用ICG(6 mg·kg-1)注射液自耳緣靜脈注入，行ICGA檢查，按照熒光充盈點(diǎn)數(shù)與有效激光點(diǎn)數(shù)的比值，計(jì)算CNV 發(fā)生率，并測(cè)量CNV滲漏面積。

1.2.3.2 病理組織切片 HE 染色各組大鼠選取視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)完整連續(xù)的石蠟切片，放入 60 ℃ 恒溫箱中烤片保持30 min；使用二甲苯液脫蠟，使用體積分?jǐn)?shù)75%、90%、100%酒精脫水；漂洗后使用蘇木精染色3 min，再次漂洗后使用10 g·L-1酸酒分色后氨水返藍(lán)15 s；繼續(xù)使用蒸餾水漂洗，伊紅染色 3 min，蒸餾水漂洗；中性樹(shù)脂封片并行顯微鏡觀察。

1.2.3.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平Western blot方法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，使用蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。以目的蛋白條帶與 β-actin 灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和GraphPda Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析作圖，整體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK方法；檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠CNV的發(fā)生率相比模型組，低劑量康柏西普組和高劑量康柏西普組大鼠ICGA熒光點(diǎn)數(shù)和CNV發(fā)生率顯著降低；且高劑量康柏西普組上述指標(biāo)均低于低劑量康柏西普組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠CNV的發(fā)生率

組別眼數(shù)有效激光點(diǎn)數(shù)ICGA熒光點(diǎn)數(shù)CNV發(fā)生率/%空白對(duì)照組----模型組101007272低劑量康柏西普組101006060高劑量康柏西普組101005454

2.2 各組大鼠ICGA檢查CNV滲透面積相比空白對(duì)照組，模型組大鼠CNV滲透面積顯著增加(P<0.05，圖1)；相比模型組，低劑量康柏西普組和高劑量康柏西普組大鼠CNV滲透面積顯著減小；且高劑量康柏西普組CNV滲透面積小于低劑量康柏西普組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.3 各組大鼠眼底FFA檢查結(jié)果空白對(duì)照組大鼠基本無(wú)熒光素滲漏(圖2)；模型組大鼠有較為嚴(yán)重的熒光素滲漏；低劑量康柏西普組有小部分的熒光素滲漏，且面積小于模型組；高劑量康柏西普組可見(jiàn)熒光著色，少量滲漏且不明顯。

圖1 各組大鼠ICGA檢查CNV滲透面積比較

2.4 HE染色結(jié)果空白對(duì)照組大鼠RPE層、脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)清晰且完整(圖3)。模型組大鼠脈絡(luò)膜、Bruch膜和RPE層結(jié)構(gòu)不連續(xù)，內(nèi)、外核層處可見(jiàn)組織構(gòu)造紊亂，并可見(jiàn)異常增生的細(xì)胞突破脈絡(luò)膜血管網(wǎng)的基底膜。低劑量康柏西普組和高劑量康柏西普組視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜被破壞的面積顯著小于模型組，且高劑量康柏西普組視網(wǎng)膜損傷面積最小。

2.5 大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α、AKT、VEGF蛋白的表達(dá)相比空白對(duì)照組，模型組大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α、AKT和VEGF蛋白的表達(dá)均顯著升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05，圖4)；相比模型組，低劑量康柏西普組和高劑量康柏西普組大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α、AKT和VEGF蛋白的表達(dá)均顯著降低，且高劑量康柏西普組中上述指標(biāo)顯著均低于低劑量康柏西普組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

圖2 各組大鼠眼底FFA檢查結(jié)果。A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：低劑量康柏西普組；D：高劑量康柏西普組

圖3 HE染色結(jié)果。A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：低劑量康柏西普組；D：高劑量康柏西普組

圖4 大鼠視網(wǎng)膜中 HIF-1α、AKT和VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：低劑量康柏西普組；D：高劑量康柏西普組；與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

3 討論

新生血管目前主要治療方法包括：玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物和手術(shù)治療等[10]。臨床上使用的抗VEGF藥物主要包括康柏西普、雷珠單抗、貝伐單抗等[11]。其中康柏西普不僅可以與VEGF特異性結(jié)合并且使VEGF 不能和受體結(jié)合，同時(shí)也可以阻斷VEGF受體的來(lái)源使VEGF失去活性，促進(jìn)新生的毛細(xì)血管逐漸萎縮，達(dá)到控制眼部新生血管繼續(xù)生長(zhǎng)的作用。

CNV在眼部的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，王哲哲等[12]研究表明，VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的促血管生成因子，在CNV形成過(guò)程中VEGF起著主要的調(diào)控作用，且是新血管形成的必要條件。VEGF家族主要為VEGF-A和VEGF-B，VEGF-A主要負(fù)責(zé)新生血管形成生長(zhǎng)，可以通過(guò)結(jié)合VEGFR-2受體誘導(dǎo)新生血管的形成，在新血管形成生長(zhǎng)中VEGF-B主要通過(guò)增生以及分解毛細(xì)血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)而誘導(dǎo)新生血管的生成。楊琳紅等[13]研究表明，HIF-1α通道是調(diào)控VEGF高表達(dá)的重要信號(hào)通道；AKT是調(diào)節(jié)其表達(dá)的主要上游因子。李悅等[14]研究表明，在正常條件下，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α?xí)话|(zhì)中的蛋白水解酶水解成小分子片段，失去生物學(xué)功能，處于一種不斷合成與水解的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，且較少被檢測(cè)到。在AKT轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路中，AKT可以增加細(xì)胞內(nèi)可用的HIF蛋白池，提高HIF-1α蛋白的合成速率達(dá)到調(diào)節(jié)HIF-1α活性的作用，同時(shí)HIF-1α可與VEGF基因的HIF對(duì)應(yīng)點(diǎn)相契合，并促使VEGF轉(zhuǎn)錄，使其高表達(dá)；VEGF的濃度升高，促進(jìn)CNV的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，相比空白對(duì)照組，模型組大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α、VEGF和AKT蛋白表達(dá)顯著增加，使用康柏西普后，大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的HIF-1α、VEGF和AKT蛋白表達(dá)顯著減少，康柏西普作為一種抗VEGF藥物可以抑制大鼠的AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制VEGF的表達(dá)，減少CNV的生長(zhǎng)，說(shuō)明抑制AKT的表達(dá)可以顯著降低CNV的發(fā)生。周小軍[15]研究表明，降低VEGF、HIF-1α的表達(dá)可以抑制CNV的生長(zhǎng)，與本研究結(jié)論一致。

綜上所述，康柏西普可以減少實(shí)驗(yàn)性CNV的生成并對(duì)視網(wǎng)膜功能起到保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜中HIF-1α、AKT和VEGF的表達(dá)，從而抑制由氪激光光凝眼底而產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)性CNV生長(zhǎng)有關(guān)。但因?qū)嶒?yàn)性CNV涉及到的蛋白表達(dá)和信號(hào)通路較為復(fù)雜，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以進(jìn)一步探討其他蛋白表達(dá)及信號(hào)通路對(duì)實(shí)驗(yàn)性CNV的作用機(jī)制。