原花色素對釀酒酵母cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響

祝凱麗，商文倩，史明珠，張慧，李靜媛

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266109)

氧化脅迫是葡萄酒發(fā)酵過程中經(jīng)常面臨的脅迫之一[1]。釀酒酵母在面臨H2O2脅迫時(shí)會(huì)表現(xiàn)出菌體生長受到抑制和細(xì)胞相應(yīng)的防御基因會(huì)發(fā)生變化[2]。cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞胞外信號分子與受體相結(jié)合，從而引起胞內(nèi)cAMP的水平變動(dòng)而調(diào)解酵母細(xì)胞代謝、增殖、分化、壓力抗性等。cAMP是細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生物學(xué)功能的重要物質(zhì)，它廣泛參與機(jī)體內(nèi)的各種生理活動(dòng)，是生物體內(nèi)重要的第二信使[3]。PKA是釀酒酵母中蛋白激酶A，其活性與海藻糖含量之間具有密切相關(guān)性[4]。海藻糖是一種非還原性的二糖，由葡萄糖以α，α-1，1糖苷鍵連接而成，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在高溫、高滲透壓、酒精、氧化等逆境環(huán)境中能夠保護(hù)微生物細(xì)胞質(zhì)膜的完整性和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[5-7]。本實(shí)驗(yàn)以原花色素為切入點(diǎn)，將原花色素與cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相聯(lián)系，通過考察酵母在氧化脅迫中內(nèi)源性海藻糖的積累情況及胞內(nèi)海藻糖的逆境合成信號傳遞系統(tǒng)，分析酵母逆境防御應(yīng)答機(jī)制及原花色素在此機(jī)制中起到的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 酵母菌株

SaccharomycescerevisiaeAWRI R2由Marivin(Australian)公司商業(yè)化，具有良好的發(fā)酵性能。

1.1.2 主要試劑

原花色素、cAMP標(biāo)準(zhǔn)品(純度為97.71%)，購于北京索萊寶科技有限公司；海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，購于北京萬佳首化生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，購于天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Mix，gDNA remover selected)，購于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10。

模擬葡萄汁(model synthetic meddium，MSM)培養(yǎng)基：由陳琳等首先使用，模擬標(biāo)準(zhǔn)葡萄汁中確定的化學(xué)成分，該培養(yǎng)基模擬釀酒酵母的發(fā)酵環(huán)境，適于研究葡萄酒釀造酵母的生物發(fā)酵特性[8]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵體系

將培養(yǎng)體系分別置于確定的氧化脅迫條件下。外加一定濃度的原花色素，設(shè)定對照，發(fā)酵體系如表1所示。

表1 不同發(fā)酵體系濃度梯度Table 1 Concentration gradient of different fermentation systems

1.2.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在進(jìn)行發(fā)酵前將酵母菌AWRI R2接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min，12～14 h富集酵母菌。二次活化接種到50%培養(yǎng)基中富集12～14 h后，接種到培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)。定時(shí)稱重確定最終取樣時(shí)間。

1.2.3 酵母細(xì)胞破碎

離心收集細(xì)胞，用冰冷的 0.1 mol/L的咪唑鹽酸緩沖液(含 1 mmol/L DTT， pH=7.4)沖洗2次。250 mg(濕重)菌體與 0.5 mL上述緩沖液混合，0 ℃超聲破碎(80 個(gè)循環(huán)，每循環(huán)破碎 3 s，停 3 s)， 4 ℃離心取上清液用于酶活、cAMP等的測定。

1.2.4 酵母細(xì)胞內(nèi)cAMP含量

參照蘇豫梅等[9]的方法。色譜條件：色譜柱為HydersirBDSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、流動(dòng)相為V(0.1mol/L KH2PO4)∶V(甲醇)=85∶15、流速為1.0 mL/min、柱溫35℃、進(jìn)樣量5 μL、檢測波長254 nm,定量方法：采用外標(biāo)法按峰面積進(jìn)行定量。

cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取適量cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，加去離子水溶解后設(shè)置不同濃度梯度的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，分別為1、4、8、10、20 mg/L，過0.45μm濾膜，在前述的色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜峰面積，以cAMP含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 酵母菌海藻糖含量測定

按LIU等[10]的方法，海藻糖的檢測使用高效液相色譜儀(Waters 2695， Milford， MA， USA)，色譜柱為Aminex HPX-87H (300mm×7.8mm) (Bio-Rad, USA)。柱溫65℃,流動(dòng)相為 0.005 mol/L H2SO4，流速為 0.600 mL/min。檢測器選擇示差檢測器,進(jìn)樣量為 5 μL。

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取適量海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置不同的濃度梯度，分別為1、4、8、10、20 mg/L的標(biāo)樣，過0.45μm濾膜，在前述的色譜條件下進(jìn)行檢測分析，記錄色譜峰面積，以海藻糖含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 環(huán)腺苷酸環(huán)化酶酶活測定

參照侯曉月等[11]的試驗(yàn)方法，把Na2ATP作為反應(yīng)底物，反應(yīng)1 min后所產(chǎn)生cAMP的含量(μg/mL)。然后參照蘇豫梅等[9]的方法測cAMP含量。

腺苷酸環(huán)化酶的測定方法：向含有沉淀的EP管里加入80 μL 30℃預(yù)熱的31 mmol/L Na2ATP溶液和31 mmol/L MnCl2溶液，再加入30℃預(yù)熱的840 μL 0.31 mol/L MES緩沖液，將加入反應(yīng)混合物的EP管于30℃保溫10 min。終止酶活反應(yīng)采用煮沸法，沸水浴煮沸1min后，讓酶失活。冷卻、離心、過濾，用液相色譜法測定濾液中的cAMP含量。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

一個(gè)單位酶活(Unit)的定義為：在上述實(shí)驗(yàn)條件下，每min產(chǎn)生1 μmol cAMP所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

1.2.7 熒光定量PCR分析

1.2.7.1 酵母RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

總RNA的提取；

(1)50～100 mg菌體在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μL RL，旋渦振蕩混勻，56 ℃孵育3 min。

(2)所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，12 000 r/min離心5 min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的離心管中。

(3)緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇(通常為225 μL)，混勻(此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀)，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，1 200r/min離心30～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

(4)向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白RW1，12 000 r/min離心30～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

(5)DNase I工作液的配制：取10 μL DNase I儲(chǔ)存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70 μL RDD溶液，輕柔混勻。

(6)向吸附柱CR3中央加入80 μL的DNase I工作液，室溫放置15 min。

(7)向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12 000 r/min離心30～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

(8)向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW，室溫靜置2min,12 000 r/min離心30～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

(9)重復(fù)步驟8

(10)12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CR3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(11)將吸附柱CR3放入一個(gè)新的RNase-Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30～100 μL RNase-Free ddH2O，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，得到RNA溶液。-80℃保存RNA樣本。

反轉(zhuǎn)錄：

(1)將RNA模板，RNase-Free water，10 x gDNA remover buffer置于冰上融解備用。

(2)在無核酸酶的微量離心管中按表2配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(10 μL)：

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Table 2 Reverse transcription reaction system

注：用槍頭輕輕混勻，短暫離心后，42℃孵育2min，隨后60℃孵育5min。

(3)混合物迅速置于冰上冷卻，短暫離心后加入表3所示組分：

表3 熒光定量體系Table 3 Fluorescence quantitative system

(4)用槍頭輕輕混勻，短暫離心后，50℃孵育15min，85℃孵育5min，置于冰上或冷藏備用。

1.2.7.2 引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)如表4所示。

表4 Real-time PCR所需的引物Table 4 Primers required for real-time PCR

注：據(jù)報(bào)道酵母的Actin基因在發(fā)酵過程中的表達(dá)量沒有變化，被作為參照。其他基因的表達(dá)量需要與此基因相比得到。

1.2.7.3 熒光定量PCR程序

熒光定量PCR程序采用20 μL體系，程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性1 min， 95 ℃變性10 s，55 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸15 s。

樣品送往青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌生長曲線

圖1中酵母菌的生長速度呈現(xiàn)明顯的差別，添加H2O2的體系中酵母菌的增長速度最慢，而添加了H2O2后再加入原花色素的體系酵母菌的生長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過只添加原花色素的體系，甚至超過了空白組。由此可見，H2O2營造的氧化脅迫條件抑制了酵母菌的繁殖與增長，而在氧化脅迫條件下加入原花色素可以促進(jìn)酵母菌的繁殖與增長。為研究添加原花色素后培養(yǎng)體系中的變化，將從海藻糖含量以及關(guān)鍵代謝通路等指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 酵母菌的生長曲線Fig.1 Yeast growth curve

2.2 胞內(nèi)海藻糖含量

海藻糖作為應(yīng)激代謝的產(chǎn)物，在不同的脅迫條件下會(huì)保護(hù)生物大分子[12-14]。由圖2可知不同發(fā)酵體系中酵母胞內(nèi)海藻糖含量差異非常明顯。添加H2O2的體系中胞內(nèi)海藻糖最低，而添加H2O2后加入原花色素后胞內(nèi)海藻糖的含量明顯升高，且高于空白組，這說明原花色素可以刺激酵母在氧化脅迫條件下產(chǎn)生海藻糖抵抗逆境。

圖2 不同發(fā)酵體系中酵母胞內(nèi)海藻糖含量Fig.2 Intracellular trehalose content of yeast in different fermentation systems

然而原花色素作為大分子物質(zhì)，無法進(jìn)入細(xì)胞，不能直接作為信號因子調(diào)控細(xì)胞的代謝活動(dòng)來應(yīng)對發(fā)酵環(huán)境中的多種脅迫因子[15]。原花色素是如何作用于酵母，引起海藻糖含量變化起到保護(hù)酵母的作用？cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞胞外信號分子與受體相結(jié)合，從而引起胞內(nèi)cAMP的水平變動(dòng)而調(diào)解酵母細(xì)胞的各種代謝活動(dòng)的一種途徑[3]。有研究表明， PKA可調(diào)節(jié)從細(xì)胞生長到對營養(yǎng)、滲透壓和壓力的應(yīng)激反應(yīng)過程，PKA活性與海藻糖含量之間具有密切相關(guān)性[16-17]。因此為探究海藻糖變化原因，我們將從關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 cAMP及關(guān)鍵基因和酶測定

由圖3～圖6可知,不同處理的酵母菌細(xì)胞中,CYR1和Actin基因的熔解曲線均呈現(xiàn)單一峰,說明基因片段特異性良好,可以用于進(jìn)行后續(xù)的檢測。同時(shí)根據(jù)循環(huán)數(shù)曲線,設(shè)定基因CYR1閾值為558.6。

圖3 酵母胞內(nèi)cAMP的含量Fig.3 Intracellular cAMP content in yeast

圖4 不同發(fā)酵體系的腺苷酸環(huán)化酶酶活Fig.4 Adenylate cyclase enzyme activity in different fermentation systems

圖5 CYR1和Actin基因特異性片段熔點(diǎn)的Real-Time PCR分析Fig.5 Agarose gel electrophoretic analysis of the specific fragment smelting point of Actin and CYR1

圖6 基因CYR1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of gene CYR1

基因CYR1的標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.998,說明此標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-4.094X+6.156。其中Y為達(dá)到閾值所需要循環(huán)數(shù)的lg值；X為初始模板。

實(shí)時(shí)定量PCR有絕對定量和相對定量之分,絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到起始模板的精確拷貝數(shù),相對定量又分為相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法和比較CT法(2-△△CT法),通過內(nèi)參照的標(biāo)定可分析基因在樣本中的表達(dá)差異。本研究應(yīng)用2-△△CT法處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)如圖7所示。

圖7 不同發(fā)酵體系中酵母CYR1基因的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of yeast CYR1 gene in different fermentation systems

體系B中酵母菌cAMP含量最低。體系C中cAMP的含量最高，甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了空白組的含量。腺苷酸環(huán)化酶和CYR1基因呈現(xiàn)相同的趨勢，即在添加H2O2的體系中酶活和相對表達(dá)量最低，在添加H2O2后添加原花色素的體系中最高，且高于空白組，這說明原花色素是從基因水平改變了基因的表達(dá)量，最終影響了cAMP生成量。

2.4 PKA關(guān)鍵基因分析

由圖8可知,不同發(fā)酵體系中的酵母細(xì)胞中BCY1和Actin基因的熔解曲線都呈現(xiàn)出單一峰,說明該基因片段特異性較好,可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)檢測。同時(shí)根據(jù)循環(huán)數(shù)曲線,設(shè)定基因BCY1閾值為940.6。

由圖9可知,編碼基因BCY1的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.991。說明此標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-2.925X+11.85,其中Y為達(dá)到閾值所需要循環(huán)數(shù)的lg值；X為初始模板。

不同發(fā)酵體系中酵母菌BCY1基因的相對表達(dá)量如圖10所示。體系C中BCY1基因較體系A(chǔ)有所升高，體系B較體系A(chǔ)有所降低，這說明原花色素可以緩解H2O2對BCY1基因的抑制作用，并對其基因的表達(dá)起到促進(jìn)作用。有研究表明，BCY1是PKA調(diào)節(jié)亞基的編碼基因，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸cAMP含量升高時(shí)，cAMP會(huì)與PKA調(diào)節(jié)的亞基BCY1相結(jié)合，釋放出催化亞基從而激活PKA，BCY1基因的表達(dá)量會(huì)影響PKA的活性[4]。結(jié)合圖3所示，BCY1基因的相對表達(dá)量與cAMP都升高，這可能會(huì)提高PKA的含量。而PKA含量的提高可能會(huì)導(dǎo)致海藻糖含量的提高，這與圖2所示結(jié)果一致。

圖8 BCY1和Actin基因特異性片段熔點(diǎn)的Real-Time PCR分析Fig.8 Real-Time PCR analysis of specific melting points of BCY1 and Actin genes

圖9 基因BCY1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of gene BCY1

圖10 不同發(fā)酵體系中酵母BCY1基因的相對表達(dá)量Fig.10 Relative expression levels of yeast BCR1 gene in different fermentation systems

3 討論

生物體氧化還原狀態(tài)對于細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境起到重要的指示作用[18-19]。研究表明多種信號分子作用于膜受體后，可通過G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生第二信使cAMP。cAMP作為第二信使，進(jìn)一步激活PKA、Epac及下游的調(diào)控元件，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)[20]。本文中cAMP-PKA做為胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其關(guān)鍵基因CYR1的相對表達(dá)量升高使得其編碼腺苷酸環(huán)化酶酶活提高，從而使得cAMP含量升高，激活PKA。而PKA的活性與海藻糖產(chǎn)量存在密切關(guān)系，PKA的增多促使酵母產(chǎn)生海藻糖抵抗外界環(huán)境變化。

王建發(fā)等研究證明芍藥苷通過cAMP-PKA信號通路發(fā)揮對心肌梗死大鼠的保護(hù)作用,且治療作用呈劑量相關(guān)性[21]。張莘莘等研究黑靈芝多糖能夠引起胞內(nèi)cAMP濃度升高、PKA活性增強(qiáng)，從而激活小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)cAMP-PKA信號[22]。研究證明柴胡皂苷A降低IL-1β的致熱作用可通過降低下丘腦cAMP的分泌和PKA的活性，抑制胞漿信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PKA系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)[23]。三七葉總皂苷能逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠行為學(xué)癥狀以及調(diào)節(jié)海馬體cAMP、PKA、BDNF的水平。三七葉總皂苷具有良好的抗抑郁作用，其作用機(jī)制與調(diào)控海馬體cAMP、PKA、BDNF水平有關(guān)[24]。綜合前人研究，cAMP-PKA途徑的調(diào)控作用廣泛存在于生物體中，對調(diào)節(jié)各方面機(jī)能起著重要的作用，而本文也正是依托海藻糖的變化對cAMP-PKA途徑進(jìn)行了研究，CYR1作為調(diào)控cAMP的關(guān)鍵基因，CYR1的升高與cAMP的酶活呈現(xiàn)相同變化趨勢，這說明在氧化脅迫下加入原花色素可以從基因水平改變表達(dá)量，從而使得腺苷酸環(huán)化酶酶活升高，增加了cAMP的生成量；cAMP的變化導(dǎo)致PKA含量的增加，最終使得海藻糖增加，以保護(hù)酵母抵抗逆境。