L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因5′端二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)重組表達(dá)的抑制機(jī)制及消除策略

令狐梅，韓來闖，周哲敏,2，崔文璟,2*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為革蘭氏陽性菌的模式菌，在食品、醫(yī)藥、飼料、紡織等工業(yè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。隨著基因工程技術(shù)和蛋白工程技術(shù)的發(fā)展，B.subtilis憑借其清晰的遺傳背景，良好的生物安全性，豐富的遺傳操作工具以及成熟的發(fā)酵工藝等優(yōu)勢(shì)，逐漸發(fā)展成為一種成熟的合成生物學(xué)底盤[3-5]。不僅實(shí)現(xiàn)了一批工業(yè)和食品用酶的高水平制備，如蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，角質(zhì)酶等，而且成功合成多種生物基平臺(tái)化合物。

異源蛋白在原核細(xì)胞，如Escherichiacoli和B.subtilis中，蛋白表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平的調(diào)控。因此，大多數(shù)研究將異源蛋白在宿主中表達(dá)水平歸于重組表達(dá)元件的性能上。如啟動(dòng)子的強(qiáng)度對(duì)mRNA合成速率的影響，核糖體結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)度對(duì)翻譯起始頻率的影響，以及終止子的效率對(duì)mRNA穩(wěn)定性的影響等[6-8]。基于這些理論，在B.subtilis中進(jìn)行異源基因表達(dá)的策略也相應(yīng)地從啟動(dòng)子改造、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomebinding site,RBS)調(diào)控、密碼子優(yōu)化、終止子等角度出發(fā)[9-11]。ZHANG等[12]利用雙串聯(lián)啟動(dòng)子PHpaⅡ-PamyQ提高胞外蛋白β環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶、α環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶和普魯蘭酶產(chǎn)量。GUIZIOU等[13]設(shè)計(jì)一個(gè)包括啟動(dòng)子庫、RBS和蛋白質(zhì)降解標(biāo)記的基因工具箱，實(shí)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌中基因的精確調(diào)節(jié)?；虍愒幢磉_(dá)時(shí)，密碼子偏愛性對(duì)翻譯效率的影響機(jī)制已有報(bào)道[14-16]。利用轉(zhuǎn)運(yùn)稀有密碼子的tRNA過表達(dá)策略，可以提高蛋白表達(dá)[17]。

然而，近期研究發(fā)現(xiàn),核糖體與mRNA結(jié)合或占用率的增加能夠提高mRNA的穩(wěn)定性[18]。并且mRNA穩(wěn)定性和RBS強(qiáng)度之間存在顯著且普遍的相關(guān)性，在RBS翻譯效率相差87倍時(shí)對(duì)應(yīng)的mRNA水平有4.3倍的增加[19]。這些模塊化的基本元件，如啟動(dòng)子、UTR(非編碼區(qū))、RBS、終止子在與異源基因進(jìn)行組合時(shí)，功能會(huì)受到特定遺傳環(huán)境的影響，如mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[18]。這種結(jié)構(gòu)通常會(huì)在轉(zhuǎn)錄后水平影響翻譯的起始效率。具體體現(xiàn)在mRNA分子的5′-UTR區(qū)域內(nèi)存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯水平的影響[19]。近期，研究同樣發(fā)現(xiàn)mRNA轉(zhuǎn)錄后參與的對(duì)翻譯起始效率的調(diào)節(jié)作用還表現(xiàn)在異源基因5′-UTR與編碼區(qū)5′端數(shù)個(gè)核苷酸之間形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)上，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠從影響mRNA穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)翻譯速率等方面對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)[20]。最新研究同樣發(fā)現(xiàn)，mRNA分子中，編碼蛋白質(zhì)N端的序列與核糖體在這一區(qū)域覆蓋的序列發(fā)生互作形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠抑制翻譯的速率[21]。當(dāng)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)位于起始密碼子下游+1～+13，與mRNA的編碼區(qū)重疊時(shí)，翻譯起始顯著受到抑制，并且5′端RNA結(jié)構(gòu)折疊自由能與mRNA的翻譯效率之間存在定量關(guān)系[21]。由于不同的異源基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生各種不同序列的5′編碼區(qū)，在與標(biāo)準(zhǔn)化的合成生物學(xué)元件匹配后產(chǎn)生的二級(jí)結(jié)構(gòu)也具有極大的不確定性。難以通過單純改造表達(dá)元件的方法來普遍提升不同異源基因?qū)Ρ磉_(dá)元件的相容性。然而，這種異源基因轉(zhuǎn)錄出mRNA分子后，5′UTR與翻譯起始區(qū)域的編碼序列之間相互作用的特征和規(guī)律尚不明確。因此，難以有針對(duì)性地開發(fā)有效的手段來消除這種mRNA分子內(nèi)部的相互作用給異源蛋白翻譯帶來的負(fù)面效應(yīng)。目前解決此類問題的一個(gè)新的思路是利用絕緣序列(insulator)從空間上隔絕關(guān)鍵元件之間的相互作用，從而消除給轉(zhuǎn)錄和翻譯帶來的不利效應(yīng)[22]。

本研究前期發(fā)現(xiàn),赤擬谷盜Triboliumcastaneum來源的L-天冬氨酸-α-脫羧酶(PanD)在強(qiáng)啟動(dòng)子和強(qiáng)RBS調(diào)控下表達(dá)水平仍然極低，推測(cè)造成這一問題的原因是由于RBS序列與panD基因mRNA編碼區(qū)5′端的核酸序列相互作用形成了二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致翻譯抑制。因此，基于這一問題，本實(shí)驗(yàn)深入探討panD基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)影響蛋白質(zhì)翻譯效率的機(jī)理，同時(shí)探索利用在PanD蛋白N端融合肽段作為絕緣序列，緩解蛋白質(zhì)翻譯抑制現(xiàn)象。這一結(jié)果能為提升異源蛋白的表達(dá)提供一種通用、可靠的新策略。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和引物

大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109和枯草芽孢桿菌B.subtilis168，分別用于質(zhì)粒構(gòu)建以及目的蛋白的表達(dá)，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏；實(shí)驗(yàn)涉及的質(zhì)粒見表1。所用到的引物及序列見表2。

表1 本研究所用質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this study

注：括號(hào)里表示質(zhì)粒的縮寫，6表示RBS206, W表示啟動(dòng)子PsigW, H表示啟動(dòng)子PspovG, P表示PanD，G表示sfGFP，M表示mCherry。

1.1.2 主要試劑

十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購于天根生化科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、抗生素、DNA Marker、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Broad)、Prime STAR MIX DNA聚合酶、DpnI DNA消化酶,購于TaKaRa；衍生試劑苯異硫氰酸酯(PITC)，購于Sigma公司；L-天冬氨酸鈉、β-丙氨酸、磷酸吡哆醛(PLP)、0.45 μm、0.22 μm無菌針頭式有機(jī)濾膜，購買于上海生工生物工程公司;K2HPO4、KH2PO4、瓊脂粉，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

基因擴(kuò)增(PCR)儀、凝膠成像儀、蛋白電泳儀，美國伯樂有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，美國SONICS公司；立式高壓蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠；HYG-A全溫?fù)u瓶柜，江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；KQ-100超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；磁力攪拌器漩渦振蕩器，IKA公司；電子天平、pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)有限公司；多功能酶標(biāo)儀，BioTeck公司(美國)；高效液相色譜儀，安捷倫(Agilent)公司。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 10.0。固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉?？剐院Y選時(shí)補(bǔ)加終質(zhì)量濃度為100 mg/L的氨芐青霉素(Ampicillin)或 50 mg/L的卡那霉素(Kanmycin)。

1.1.5 主要溶液

高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)流動(dòng)相：A液：體積分?jǐn)?shù)為80%的乙腈-水溶液；B液：體積比為97 ∶3的0.1 mmol/L醋酸鈉-乙腈溶液。使用前用0.22 μm有機(jī)濾膜抽濾去除雜質(zhì)。

β-丙氨酸衍生試劑：0.1 mmol/L PITC-乙腈：取1 mL 苯異硫氰酸酯(phenyl isothiocyante,PITC)充分溶解于83 mL色譜純乙腈溶液中。1 mmol/L三乙胺-乙腈∶14 mL色譜純?nèi)野啡芤号c86 mL色譜純乙腈溶液充分混勻。密封、避光低溫保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

L-天冬氨酸-α-脫羧酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：實(shí)驗(yàn)室前期克隆并鑒定了強(qiáng)啟動(dòng)子PsigW(縮略為W)和PspovG(縮略為H)，并且利用在線預(yù)測(cè)軟件(RBS Calculator)為這兩個(gè)啟動(dòng)子配置強(qiáng)RBS序列，RBS206 (序列為TCGAACATCATATTTAAAGTAAAGGAGGTCCACAT,縮略為6)。編碼綠色熒光蛋白基因sfgfp的E.coli-B.subtilis穿梭載體pBsigW206-sfgfp(縮略為6WG)和pBspovG206-sfgfp(縮略為6HG)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。以質(zhì)粒6WG和6HG為模板，用引物PB-H-1/ PB-206-2(表2)擴(kuò)增質(zhì)粒骨架。將密碼子優(yōu)化合成后的赤擬谷盜來源的panD基因用引物PanD-1/ PanD-H-2(表2)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物加入Dpn I酶消化2 h，純化后進(jìn)行Gibson組裝[23]，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。重組質(zhì)粒命名為pBsigW206-panD(縮略為6WP)和pBspovG206-panD(縮略為6HP)。將正確的重組質(zhì)粒用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化入枯草芽胞桿菌168中[24]，獲得基因工程菌進(jìn)行搖瓶檢測(cè)。

L-天冬氨酸-α-脫羧酶C末端融合sfGFP質(zhì)粒的構(gòu)建：分別以質(zhì)粒6WG和6HG為模板，用引物PB-206-2/ PG-1(表2)擴(kuò)增質(zhì)粒骨架，引物PanD-1/ PanD-2(表2)擴(kuò)增panD基因，分別得到重組質(zhì)粒pBsigW206-panD-sfgfp(縮略為6WPG)和pBspovG206-panD-sfgfp(縮略為6HPG)。

L-天冬氨酸-α-脫羧酶N末端融合sfGFP質(zhì)粒的構(gòu)建：分別以質(zhì)粒6WG和6HG為模板,以PB-H-1/ sfGFP-2為引物擴(kuò)增質(zhì)粒骨架，以PanD-1/ PanD-H-2為引物克隆panD基因，利用Gibson組裝的方法，將panD基因插入到sfgfp基因下游，分別得到重組質(zhì)粒pBsigW206-sfgfp-panD(縮略為6WGP)和pBspovG206-sfgfp-panD(縮略為6HGP)。

為了探討panD基因5′端翻譯起始區(qū)域mRNA序列對(duì)翻譯水平的影響，采用截?cái)嗖呗?，從panD基因mRNA 5′端起始密碼子后依次截去9、18、27、36、45和54 nt，構(gòu)建出PanD酶N端不同長(zhǎng)度截?cái)嗥蔚耐蛔凅w。為了使用膠上熒光監(jiān)測(cè)(In-gel) SDS-PAGE的方法檢測(cè)融合蛋白，PanD酶的C端融合sfGFP。構(gòu)建方法：以6HPG為模板，以D3-1, D6-1, D9-1, D12-1, D15-1, D18-1/ 206-2為引物，PCR擴(kuò)增帶有同源臂到的片段，55 ℃反應(yīng)50 min進(jìn)行片段組裝，之后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)，獲得6種含有N端截?cái)嚅L(zhǎng)度逐個(gè)遞增的融合蛋白突變體質(zhì)粒：pBspovG206-D3-panD-sfgfp(D3-6HPG), pBspovG 206-D6-panD-sfgfp(D6-6HPG), pBspovG206-D9-panD-sfgfp(D9-6HPG), pBspovG206-D12-panD-sfgfp(D12-6HPG), pBspovG206-D15-panD-sfgfp(D15-6HPG)和pBspovG206-D18-panD-sfgfp(D18-6HPG)。測(cè)序驗(yàn)證后保存?zhèn)溆谩?/p>

為了對(duì)融合肽長(zhǎng)度進(jìn)行精簡(jiǎn)，根據(jù)sfGFP和mCherry的蛋白質(zhì)序列和蛋白結(jié)構(gòu)，以N端含有的β折疊或α螺旋的不同長(zhǎng)度結(jié)構(gòu)域作為短融合肽，保留sfGFP N端前50、91和143個(gè)氨基酸分別與PanD進(jìn)行N端融合表達(dá)，進(jìn)行以下構(gòu)建：以6HGP為模板，以G50-2, G91-2, G143-2/ PanD-1為引物，構(gòu)建質(zhì)粒pBspovG206-sfgfp50-panD(G50P)， pBspovG206-sfgfp91-panD(G91P)和pBspovG206-sfgfp143-panD(G143P)。保留mCherry N端前62和144個(gè)氨基酸分別與PanD進(jìn)行N端融合表達(dá)。以6HP為模板，以PanD-1/ PB-206-2為引物擴(kuò)增質(zhì)粒骨架，以M-1/M-2，M62-2，M144-2為引物擴(kuò)增mcherry基因，通過組裝的方法構(gòu)建質(zhì)粒pBspovG206-mcherry-panD(6HMP), pBspovG206-mcherry62-panD(M62P)和pBspovG206-mcherry144-panD(M144P)。

1.2.2 sfGFP熒光水平的測(cè)定

將包含正確質(zhì)粒的B.subtilis菌株在終質(zhì)量濃度50 mg/L的卡那霉素LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)長(zhǎng)出單菌落。再接種單菌落到5 mL的LB試管培養(yǎng)基37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。再以1%的接種量接種到終質(zhì)量濃度為50 mg/L的卡那霉素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。取200 μL發(fā)酵液至96孔板，檢測(cè)OD600和sfGFP熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity,FI)。在激發(fā)光495 nm，發(fā)射光525 nm處進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 PanD酶活水平的測(cè)定

酶活水平檢測(cè)方法：參考之前相關(guān)報(bào)道[25],取200 μL細(xì)胞破碎后PanD粗酶液，加入終濃度為100 mmol/L的L-天冬氨酸溶液和0.1 mol/L PLP,50 mmol/L磷酸鹽緩沖液補(bǔ)加到1 mL, 37 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系于100 ℃滅活10 min，12 000 r/min離心5 min，取上層溶液進(jìn)行衍生。

β-丙氨酸的衍生：由L-天冬氨酸和β-丙氨酸在進(jìn)行HPLC檢測(cè)時(shí)較難分離，因此參考文獻(xiàn)[26]，在檢測(cè)前用PITC進(jìn)行衍生。衍生方法為取500 μL反應(yīng)液，加入250 μL 1 mol/L三乙胺-乙腈溶液和250 μL 0.1 mol/L PITC-乙腈溶液，振蕩混勻，避光反應(yīng)1 h。待衍生結(jié)束后，700 μL正己烷，振蕩30 s萃取出殘余的衍生試劑，靜置，待反應(yīng)液有明顯分層后吸取下層溶液，用0.22 μm針頭式有機(jī)濾膜過濾。

HPLC檢測(cè)β-丙氨酸生成：選擇C18色譜柱La Chrom C18(5 μm 4.6×250 mm)，參考相關(guān)文獻(xiàn)[27]，用梯度洗脫的方法進(jìn)行檢測(cè)。A流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈溶液，B流動(dòng)相為體積比97∶3的0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈溶液；梯度洗脫條件為：0～35 min，B流動(dòng)相由95%降至65%；35～40 min，B流動(dòng)相由65%升至95%；40～45 min，B流動(dòng)相濃度不變。檢測(cè)溫度為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

酶活定義：在37 ℃，pH 7.0的條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成1 mmol β-丙氨酸所需酶量為一個(gè)酶活力單位1 U。

1.2.4 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

SDS-PAGE：取培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液1 mL， 2 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次，再用含有200 μg/mL溶菌酶的500μL的TE緩沖液Buffer懸浮，37 ℃溫育30 min，未完全裂解的菌液用超聲適當(dāng)破碎；取100 μL細(xì)胞裂解液，加入25 μL 5 ×上樣緩沖液，沸水浴10 min。使用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行蛋白分離，考馬斯亮藍(lán)R250染色顯示條帶。

In-gel[28]檢測(cè)：取100 μL裂解好的細(xì)胞破碎液，加入25 μL 5×上樣緩沖液混勻。用不含SDS的蛋白膠進(jìn)行分離，凝膠成像儀在紫外燈下成像，可特異性地顯示目的蛋白，過濾掉其他不發(fā)光的背景蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤擬谷盜L-天冬氨酸-α-脫羧酶在B. subtilis中表達(dá)抑制效應(yīng)的鑒定

為了實(shí)現(xiàn)赤擬谷盜L-天冬氨酸-α-脫羧酶在B.subtilis中的高效表達(dá)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的PsigW-206和PspovG-206啟動(dòng)子-RBS強(qiáng)表達(dá)元件介導(dǎo)sfGFP表達(dá)的6WP和6HP表達(dá)水平在B.subtilis168中進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖1-A，含有206的2個(gè)啟動(dòng)子均介導(dǎo)sfGFP的高水平表達(dá)。隨后將密碼子優(yōu)化后的panD基因克隆到這2個(gè)表達(dá)元件的下游，進(jìn)行重組表達(dá)驗(yàn)證。結(jié)果如圖1-B所示，在PsigW-206和PspovG-206這2種表達(dá)元件介導(dǎo)的PanD重組表達(dá)系統(tǒng)中，PanD蛋白的理論分子質(zhì)量62 kDa處均沒有明顯條帶，這一結(jié)果表明，這2種高效表達(dá)元件并不能介導(dǎo)PanD在B.subtilis168中的高水平表達(dá)。綜合圖1-A和圖1-B的結(jié)果，推測(cè)PanD表達(dá)量低是由于翻譯抑制引起的。

A-PsigW-206與PspovG-206介導(dǎo)sfGFP表達(dá)；B-PsigW-206與PspovG-206介導(dǎo)PanD表達(dá)；圖1 SDS-PAGE檢測(cè)啟動(dòng)子-RBS組合介導(dǎo)PanD和sfGFP的表達(dá)水平Fig.1 SDS-PAGE analysis to measure the expression levels of PanD and sfGFP mediated by promoter-RBS combination注：M-蛋白Marker；168-對(duì)照；W-啟動(dòng)子PsigW；H-啟動(dòng)子PspovG；G-sfGFP；P-PanD；黑色箭頭所指位置為目的條帶位置。

2.2 panD基因mRNA 5′端二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)重組蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用

為了闡明PanD翻譯抑制的機(jī)理，著重探討panD基因轉(zhuǎn)錄后的mRNA 5′編碼區(qū)與5′-UTR之間相互作用形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯的影響。因此，從起始密碼子AUG開始，以每次缺失9 bp(3個(gè)氨基酸殘基)的方式逐步截?cái)鄊RNA 5′端序列，構(gòu)建一系列5′端序列逐步縮短的突變體。為了使用In-gel方法對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以編碼融合蛋白PanD-sfGFP的panD-sfgfp基因(6HPG)為模板，構(gòu)建mRNA 5′端分別缺失9 nt (D3-6HPG), 18 nt (D6-6HPG), 27 nt (D9-6HPG), 36 nt (D12-6HPG), 45 nt (D15-6HPG)和54 nt (D18-6HPG)的截?cái)嗤蛔凅w。隨后轉(zhuǎn)入B.subtilis168宿主，確定各突變體表達(dá)水平。SDS-PAGE和In-gel檢測(cè)結(jié)果如圖2-A,圖2-B所示，5′端缺失9 bp后對(duì)應(yīng)重組融合蛋白D3-6HPG的表達(dá)水平相比野生型6HPG有提升。與此類似，突變體D12-6HPG、D15-6HPG和D18-6HPG均有不同程度的提升。而D6-6HPG和D9-6HPG的表達(dá)水平相對(duì)于野生型融合蛋白沒有明顯提升。In-gel與SDS-PAGE結(jié)果一致，如圖2-C所示。

A-SDS-PAGE檢測(cè)；B-In-gel檢測(cè)；C-截?cái)嗳诤系鞍谉晒馑綑z測(cè)；D-酶活性檢測(cè)圖2 panD-sfgfp基因5′端序列的梯度截?cái)嗤蛔凅w表達(dá)量的檢測(cè)Fig.2 Detection of mutants expression of the panD-sfgfp gene 5′-terminal sequence gradient truncation注：M：蛋白marker；6HPG：PspovG-206介導(dǎo)C端融合蛋白PanD-sfGFP的表達(dá)；D3-6HPG、D6-6HPG、D9-6HPG、D12-6HPG、D15-6HPG和D18-6HPG：panD-sfgfp序列5′端依次截去9、18、27、36、45和54 nt后的突變體；黑色箭頭所指位置為目的條帶位置。

這一結(jié)果表明,panD轉(zhuǎn)錄本中mRNA 5′端結(jié)構(gòu)是影響重組蛋白表達(dá)水平的一個(gè)重要因素。對(duì)各突變體的酶活水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2-D所示，突變體D3-6HPG酶活水平相較于野生型有所提升，與突變體蛋白質(zhì)表達(dá)水平一致。而D6-6HPG、D9-6HPG和D12-6HPG突變體酶活水平有所降低，這一結(jié)果與蛋白表達(dá)水平也趨于一致。但D15-6HPG和D18-6HPG酶活水平與野生型無顯著差異，結(jié)合圖2-B中蛋白表達(dá)水平的結(jié)果，提示這2個(gè)經(jīng)過截?cái)嗟耐蛔凅w雖然蛋白質(zhì)表達(dá)水平有所提升，但對(duì)酶活性有一定影響。

為進(jìn)一步揭示mRNA轉(zhuǎn)錄本中5′-UTR區(qū)域和翻譯起始覆蓋的編碼區(qū)域之間的相互作用對(duì)翻譯水平的影響，通過RNAfold在線軟件分析野生型panD和截?cái)嗤蛔凅wmRNA 5′端二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征。結(jié)果如圖3-A～圖3-G所示，在轉(zhuǎn)錄出的野生型panD的mRNA(6HPG)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，RBS序列形成一個(gè)小發(fā)卡結(jié)構(gòu)，同時(shí)起始密碼AUG下游12 nt的序列形成了較穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，推測(cè)這種較穩(wěn)定的雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)阻礙了翻譯起始過程中核糖體的結(jié)合，從而對(duì)PanD的表達(dá)造成極大的抑制。

圖3 panD-sfgfp基因5′端序列的梯度截?cái)嗤蛔凅w的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及最小自由能ΔG值Fig.3 mRNA secondary structure and minimum free energy ΔG value of gradient truncation mutants of the panD-sfgfp gene 5′-terminal sequence注：黑體標(biāo)注為RBS序列AAAGGAGGU；斜體標(biāo)注為起始密碼子AUG。

為了驗(yàn)證這一推測(cè)，對(duì)5′端截?cái)嗟耐蛔凅w基因序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，與6HPG相比，刪除起始密碼子下游9 pb (D3-6HPG)后，5′-UTR中RBS序列所在的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被消除，與核糖體緊密結(jié)合的保守序列AAGGAG序列處于有利于核糖體結(jié)合的延展?fàn)顟B(tài)。而蛋白表達(dá)相對(duì)較低的D6-6HPG和D9-6HPG的mRNA 5′端序列則半覆蓋或完全覆蓋在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，并且其二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能ΔG值也相對(duì)較低，表明這種抑制性的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。同時(shí)D12-6HPG和D15-6HPG mRNA的RBS序列只有2個(gè)或3個(gè)堿基存在于發(fā)夾莖的基部。D18-6HPG mRNA的RBS雖然完全覆蓋在發(fā)夾莖結(jié)構(gòu)中但是ΔG值相對(duì)較高。因此，結(jié)合圖2-B，這一結(jié)果表明，mRNA 5′端編碼序列通過與5′-UTR中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)相互作用形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響核糖體結(jié)合，并最終導(dǎo)致對(duì)mRNA的翻譯效率的抑制。值得注意的是mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與mRNA的蛋白編碼區(qū)重疊且最小自由能最低的D6-6HPG突變體的蛋白表達(dá)水平和酶活也是最低的，說明蛋白編碼序列與5′-UTR形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠顯著抑制翻譯效率，并且這種抑制效應(yīng)與最小自由能相關(guān)。

2.3 利用N端融合策略消除PanD翻譯抑制

為了降低mRNA編碼區(qū)序列與5′-UTR形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)翻譯起始效率的影響，研究選取能夠適用于大多數(shù)表達(dá)元件或系統(tǒng)的且蛋白結(jié)構(gòu)解析清楚的sfGFP作為N端融合肽，構(gòu)建N端融合蛋白6WGP和6HGP。同時(shí)與PanD C端融合sfGFP的6WPG和6HPG的表達(dá)水平進(jìn)行比較。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖4-A、圖4-B所示，N端融合蛋白6HGP的表達(dá)水平明顯高于N端融合蛋白6WGP、C端融合蛋白6WPG和C端融合蛋白6HPG。In-gel與SDS-PAGE結(jié)果一致，如圖4-C所示。這一結(jié)果表明N端融合sfGFP可以有效解除翻譯抑制效應(yīng)，顯著提升蛋白表達(dá)水平。為進(jìn)一步考察融合策略對(duì)酶活性的影響，測(cè)定融合蛋白的酶活水平，結(jié)果如圖4-D所示，C端融合蛋白6WPG與6HPG相比較，酶活水平有所降低，這一差異與蛋白表達(dá)水平相關(guān)。N端融合蛋白6HGP與6WGP比較，酶活水平提升8倍，但融合蛋白的熒光表達(dá)水平提升17.5倍。結(jié)果表明，雖然N端融合sfGFP可以使蛋白質(zhì)表達(dá)水平有大幅度的提升，但可能會(huì)對(duì)酶分子的空間結(jié)構(gòu)有一定影響，造成酶活性不同程度的降低。

A-SDS-PAGE檢測(cè)；B-In-gel檢測(cè)；C-融合蛋白熒光水平檢測(cè)；D-酶活性檢測(cè)圖4 PanD與sfGFP融合蛋白表達(dá)量的檢測(cè)Fig.4 Detection of fusion protein expression of PanD and sfGFP注：M-蛋白marker；6WPG和6HPG:C端融合sfGFP；6WGP和6HGP:N端融合sfGFP；黑色箭頭所指位置為目的條帶位置。

2.4 融合肽長(zhǎng)度精簡(jiǎn)及篩選

為了保證N端融合sfGFP在提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平的同時(shí)又減少對(duì)融合蛋白酶活性的影響，我們采用精簡(jiǎn)sfGFP和mCherry兩種蛋白的N端策略，保留N端含有的β折疊或α螺旋的不同長(zhǎng)度的結(jié)構(gòu)域作為融合肽段，分別與PanD進(jìn)行N端融合，構(gòu)建新的融合蛋白。不同融合肽段的長(zhǎng)度如圖5-A、圖5-B豎向箭頭所指位置。在圖5-A豎向箭頭所指位置，分別保留sfGFP N端前50(G50)、91(G91)和143(G143)個(gè)氨基酸與PanD進(jìn)行融合，構(gòu)建G50P、G91P和G143P融合蛋白突變體；在圖5-B豎向箭頭所指位置，分別保留mCherry N端的前62(M62)和144(M144)個(gè)氨基酸與PanD進(jìn)行N端融合，構(gòu)建M62P和M144P融合蛋白突變體。SDS-PAGE和In-gel檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖5-C所示，保留sfGFP N端前50個(gè)氨基酸后對(duì)應(yīng)重組融合蛋白G50P的表達(dá)水平相比野生型6HP有的提升。與此類似，突變體G91P和G143P隨著保留結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度的增加表達(dá)水平均有不同程度提升。保留mCherry N端前62個(gè)氨基酸后對(duì)應(yīng)重組融合蛋白M62P的表達(dá)水平相比野生型6HP有提升。M144P表達(dá)水平雖也有提升但沒有M62P高。綜上，通過對(duì)融合肽長(zhǎng)度的縮短，構(gòu)建含有結(jié)構(gòu)域的短融合肽的融合蛋白，可以提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

3 討論

本研究揭示了一種影響赤擬谷盜L-天冬氨酸-α-脫羧酶PanD在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá)水平機(jī)制。編碼L-天冬氨酸-α-脫羧酶的基因panD在含有人工強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)元件的表達(dá)框架中受mRNA 5′-UTR和5′-編碼區(qū)序列相互作用形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)的調(diào)控，這種調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯起始階段。在這種機(jī)制調(diào)控下，PanD即使在強(qiáng)啟動(dòng)子和強(qiáng)RBS序列的介導(dǎo)下也呈現(xiàn)低表達(dá)。這一問題極大限制了重組酶在B.subtilis中的高效制備。同時(shí)，PanD是一種重要的工業(yè)酶，可用來構(gòu)建β-丙氨酸的生物催化途徑或代謝途徑[29]。傳統(tǒng)上用于提升異源基因在B.subtilis中表達(dá)水平的策略集中于改造天然啟動(dòng)子，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平，設(shè)計(jì)強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)提升翻譯起始效率等[13,30]。然而，高效的順式作用元件對(duì)異源蛋白的適配性有一定的局限，許多異源蛋白的基因序列內(nèi)部存在一些制約重組表達(dá)的天然因素。其中，最重要的一類就是異源基因mRNA 5′端形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)[21]。這種作用會(huì)導(dǎo)致核糖體結(jié)合位點(diǎn)被全部或部分封閉在由5′編碼區(qū)與5′-UTR相互作用形成的發(fā)卡或莖環(huán)等二級(jí)結(jié)構(gòu)中[22]。

A-sfGFP的蛋白序列；B-mCherry的蛋白序列；C-SDS-PAGE檢測(cè)圖5 保留sfGFP和mCherry的不同長(zhǎng)度結(jié)構(gòu)域與PanD進(jìn)行N端融合表達(dá)Fig.5 The N-terminal fusion expression of different length domains of sfGFP and mCherry with PanD注：灰色箭頭代表β折疊；黑色矩形代表α螺旋；豎向箭頭所指位置表示縮短后的融合肽序列；斜向箭頭所指位置為目的條帶位置。M-蛋白marker；168-對(duì)照；6HP-PspovG-206 介導(dǎo)PanD的表達(dá)；M62P和M144P-mCherry N端前62和144個(gè)氨基酸分別與PanD的N端融合；6HMP-PspovG-206介導(dǎo)mCherry-PanD的表達(dá)；G50P, G91P和G143P-sfGFP N端前50、91和143個(gè)氨基酸分別與PanD的N端融合；6HGP-PspovG-206介導(dǎo)sfGFP-PanD的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)PsigW-206和PspovG-206這兩種高強(qiáng)度表達(dá)組件沒有產(chǎn)出高水平的PanD重組酶。然而，在PanD的N端融合了sfGFP后，融合蛋白的表達(dá)水平顯著提升。通過進(jìn)一步對(duì)截?cái)嗳诤系鞍譵RNA 5′端核酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，我們發(fā)現(xiàn)使用強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)后，panD基因mRNA 5′端編碼區(qū)序列通過與5′-UTR的核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成不同程度的包含RBS序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而不同程度地抑制翻譯起始，并且這種抑制效應(yīng)與mRNA中核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能和相對(duì)位置有密切的關(guān)系。

如何使高效基因表達(dá)組件能夠兼容更多的異源基因，產(chǎn)出合理的表達(dá)水平對(duì)于合成生物學(xué)和代謝工程的研究具有至關(guān)重要的作用。并且在面對(duì)各種異源基因多樣化的mRNA 5′末端序列以及其可能和核糖體結(jié)合位點(diǎn)等關(guān)鍵組件形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的這些問題時(shí)，采用何種更為通用的策略能夠消除翻譯抑制，提升異源基因的表達(dá)量對(duì)構(gòu)建人工基因線路和代謝途徑尤為重要。本研究采用融合蛋白策略，逐步篩選與人工表達(dá)組件兼容性好的融合肽段與PanD酶融合，以期緩解或消除由于5′端編碼區(qū)參與形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯的抑制效應(yīng)。為此，研究選取普適性較好sfGFP作為N端融合肽，證明了在PanD的N端存在sfGFP能夠極大消除翻譯的抑制。結(jié)果充分證明了這一策略的合理性和適用性。并且通過逐步縮減融合肽的長(zhǎng)度，最大程度降低融合肽對(duì)PanD酶活性的影響。有效平衡了融合蛋白表達(dá)水平和酶活性兩方面的指標(biāo)。這種類似于融合“絕緣子”的策略近年在構(gòu)建高穩(wěn)定性、高正交性的基因轉(zhuǎn)錄元件中使用較多[31]，而直接將肽段作為“絕緣子”，依賴編碼肽段的序列不與5′-UTR產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)的特性消除翻譯抑制的策略尚無報(bào)道。本研究通過構(gòu)建基于sfGFP和mCherry的融合肽段，考察了不同長(zhǎng)度的融合肽段對(duì)PanD表達(dá)水平的影響，篩選出了具有成為“絕緣子”應(yīng)用潛能的肽段，驗(yàn)證結(jié)果同時(shí)表明，全長(zhǎng)的sfGFP介導(dǎo)的PanD蛋白表達(dá)水平最高，但保留sfGFP的N端143個(gè)氨基酸的肽段后融合蛋白的表達(dá)效果也能達(dá)到與之相當(dāng)?shù)乃?。而在利用mCherry的融合體中，全長(zhǎng)的mCherry介導(dǎo)的融合蛋白表達(dá)水平均高于N端為不同長(zhǎng)度肽段的融合蛋白的表達(dá)水平。這表明融合肽段的選擇對(duì)于這一策略具有重要的影響。研究中僅選取了兩種蛋白作為融合肽段的來源，今后的研究還可以利用這種策略設(shè)計(jì)全人工短肽序列，進(jìn)一步擴(kuò)展肽段“絕緣子”的適用范圍。因此，這一策略有望被開發(fā)成為一種便捷的技術(shù)平臺(tái)，用于系統(tǒng)提升不同異源基因在底盤細(xì)胞中的表達(dá)水平，為合成生物學(xué)和代解途徑的構(gòu)建提供通用型解決方案。