楊梅葉原飛燕草素對(duì)胰脂肪酶和磷脂酶A1的影響

周曉舟，陳士國(guó)，葉興乾

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

原花色素具有多酚類物質(zhì)普遍具有的抗氧化性等活性[1-8]，在保健品與化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用已較為普遍[9-14]，而在治療疾病方面，對(duì)心血管疾病[15-16]、糖尿病[17]、癌癥[18-19]、肥胖[20-21]、精神疾病[22-23]等也有不少相關(guān)報(bào)道。Yang Haihua等[24]的研究表明楊梅的樹葉含有豐富的原花色素，其類型基本為原飛燕草素，而原飛燕草素因?yàn)槠錀斔狨セY(jié)構(gòu)而具有更強(qiáng)大的抗氧化等生物活性[25]。在本課題組之前的研究中[26]，通過大孔樹脂對(duì)楊梅葉原飛燕草素進(jìn)行了有效提純，得到了原飛燕草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53%的楊梅葉提取物，隨后利用此提取物進(jìn)行了對(duì)肥胖治療的初步研究。其中，衡量肥胖治療效果的一個(gè)經(jīng)常采用的標(biāo)準(zhǔn)，也是檢驗(yàn)?zāi)愁愇镔|(zhì)能否抑制人體從外界攝入脂肪的檢測(cè)對(duì)象，就是胰脂肪酶或者磷脂酶的活性[27]。

脂肪酶全稱為甘油三酯基水解酶，是一種特殊的酯基水解酶。其中主要來自于胰腺的胰脂肪酶是胰腺分泌的多種消化酶之一，也是人體從外界攝入脂肪的必要消化酶之一，可水解50%～70%的膳食脂肪。脂肪酶的作用是將外界攝入的脂肪進(jìn)行分解，分解得到的甘油和脂肪酸被人體小腸吸收后，在肝臟重新合成能夠被人體利用的脂肪[28]。

磷脂酶是磷脂酶A1、A2、B、C、D等亞型的統(tǒng)稱，是能夠水解體內(nèi)以及外界攝入磷脂的一類脂質(zhì)水解酶，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在，其中磷脂酶A1主要存在于細(xì)胞溶酶體內(nèi)，能夠催化甘油磷脂的第一位酯鍵斷裂，產(chǎn)生脂肪酸，是催化分解產(chǎn)生脂肪酸的重要途徑之一。磷脂是生物膜的重要組成部分，人類通過食物的攝入從外界攝取的磷脂是人體內(nèi)磷脂組成的重要來源，同時(shí)通過磷脂酶的水解作用得到的甘油和脂肪酸也是人體重新合成脂肪的重要來源[29]。我們所食用的食物，除了甘油三酯，還存在大量的各種生物膜，因此人體攝入的脂肪總量非常大。

人體通過食物攝入的脂肪，在胰脂肪酶和磷脂酶A1的作用下，分解成大量的能夠被利用的甘油和脂肪酸。而一旦抑制了脂肪酶或者磷脂酶A1的活性，就能夠抑制人體對(duì)食物中的脂肪以及磷脂的分解，從而使得人體攝入的脂肪減少，達(dá)到抑制肥胖的目的[30]。

本實(shí)驗(yàn)采用奧利司他（Orlistat）以及文獻(xiàn)[26]中提到的楊梅葉粉末（leaf powder of Chinese bayberry，LCB）、楊梅葉含糖提取物（non-desugarized prodelphinidins extract，NDPE）和楊梅葉去糖提取物（desugarized prodelphinidins extract，DPE）作為研究對(duì)象，構(gòu)建了肥胖大鼠模型，針對(duì)胰脂肪酶和磷脂酶A1進(jìn)行了體內(nèi)外活性抑制能力的比較，并對(duì)抑制能力較好的提取物進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，包括測(cè)定其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和抑制類別，為評(píng)價(jià)其作為減肥產(chǎn)品的潛力和進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Orlistat標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁試劑有限公司；LCB、NDPE、DPE其原飛燕草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)測(cè)定分別為4.3%、26.0%、53.0%。

大豆?jié)饪s磷脂、4-甲基傘形酮油酸酯（4-methylumbelliferyl oleate，4-MUO）標(biāo)準(zhǔn)品和三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）阿拉丁試劑有限公司；豬胰腺脂肪酶、人磷脂酶A1上海勁馬生物科技有限公司；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、乙醇和鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；916Ti-Touch自動(dòng)滴定儀 瑞士萬通公司；KDS-12電熱恒溫水浴鍋嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；TD5K臺(tái)式低速離心機(jī)長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 飼料配制

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料成分表Table 1 Feed ingredients of experimental animals g/kg

大鼠飼料自行配制，具體成分如表1所示，其中礦物質(zhì)混合物及維生素復(fù)合物均參照AIN-93配方。高脂飼料由79%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）普通飼料，20%豬油和1%膽固醇組成。普通飼料與高脂飼料在經(jīng)過輻照處理后，壓模成短棍狀便于飼喂。

1.3.1.2 大鼠造模

選用雄性SD大鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6 組：NF組、HF組、Orlistat組、LCB組、NDPE組和DPE組，每組8 只，共48 只?？紤]到造膜成功性，需大鼠60 只。將60 只實(shí)驗(yàn)大鼠放入鋼絲籠內(nèi)飼喂，每籠4 只，自由攝食和飲水，每周記錄食量，連續(xù)喂養(yǎng)4 周。正常組按普通飼料喂食，模型組和治療組都按HF飼料喂食，室溫（23±2）℃，12 h明暗交替，4 周后測(cè)定體質(zhì)量，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為超過同時(shí)飼喂的正常大鼠體質(zhì)量的10%。

1.3.1.3 干預(yù)實(shí)驗(yàn)

篩選造模成功的大鼠，分別安排不同飼料繼續(xù)飼喂。正常組仍為NF組飼料，模型組為HF組飼料，干預(yù)組分別為Orlistat組、LCB組、NDPE組、DPE組飼料。室溫（23±2）℃，12 h明暗交替，每隔一周稱取一次體質(zhì)量，經(jīng)約4 周喂食，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 酶活力的測(cè)定

胰脂肪酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]，有所改動(dòng)。分別取1 mg的Orlistat、LCB、NDPE以及DPE溶解到10 mL緩沖溶液中，作為抑制劑參與抑制胰脂肪酶分解脂質(zhì)的反應(yīng)。相同環(huán)境下，在96 孔板中按順序添加25 μL抑制劑、10 μL底物4-MUO、40 μL Tris-HCl緩沖液、25 μL胰脂肪酶開始反應(yīng)，所有反應(yīng)物均使用Tris-HCl緩沖液配制成一定質(zhì)量濃度的溶液。空白對(duì)照用25 μL的Tris-HCl緩沖液替代抑制劑，在25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)一定時(shí)間后，添加100 μL pH 4.2的檸檬酸緩沖液用以使反應(yīng)停止。體內(nèi)酶活力測(cè)定時(shí)，大鼠經(jīng)過頸部脫臼處死，立即解剖后截取相同質(zhì)量的大鼠小腸段，溶于相應(yīng)的緩沖溶液中，然后進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定。

胰脂肪酶活力以由熒光強(qiáng)度計(jì)算出的抑制率作為參考標(biāo)準(zhǔn)，按公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中：Y0為空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度；Ym為無抑制劑添加組的熒光強(qiáng)度；Yn為不同抑制劑添加組的熒光強(qiáng)度。

磷脂酶A1活力檢測(cè)參考文獻(xiàn)[10]，有所改動(dòng)。將4 g的底物大豆?jié)饪s磷脂、0.5 g PVA溶于100 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，離心機(jī)1 000 r/min均質(zhì)3 min，得到底物溶液。取4 個(gè)100 mL高型燒杯，2 個(gè)作為空白瓶，2 個(gè)作為樣品瓶，各加底物溶液25 mL，再于空白瓶中加入95%乙醇15 mL，水浴預(yù)熱5 min，然后在各瓶中加入磷脂酶A1液的稀釋液1 mL（用磷酸鹽緩沖液稀釋），立即混勻計(jì)時(shí)，在水浴中反應(yīng)一定時(shí)間，于樣品瓶中立即補(bǔ)加95%乙醇15 mL終止反應(yīng)，于自動(dòng)滴定儀下用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定（按GB/T 601—2002《化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》配制和標(biāo)定，NaOH濃度為0.5 mol/L），計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)堿液平均消耗量。

磷脂酶活力定義為：在特定條件下1 min水解磷脂產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量即為一個(gè)磷脂酶活力單位（U）。對(duì)于液體酶制劑，其酶活力表示為每克酶液所測(cè)得的磷脂酶活力單位，即U/g。按公式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：V為滴定樣品時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；V0為滴定空白時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/（mol/L）；50為1.00 mL 0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于脂肪酸50 μmoL；n為酶液樣品的稀釋倍數(shù)；t為測(cè)定酶活力時(shí)的反應(yīng)時(shí)間/min。

為方便進(jìn)行比較，磷脂酶的酶活力轉(zhuǎn)化為抑制劑對(duì)磷脂酶的抑制率來表示。按公式（3）進(jìn)行計(jì)算。

式中：V為滴定樣品時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；V0為滴定空白時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL。

1.3.3 抑制類型的判定

由于待測(cè)樣品的區(qū)別在于楊梅葉原花色素質(zhì)量濃度的高低，為了更好說明楊梅葉原花色素與抑制胰脂肪酶和磷脂酶A1活性的構(gòu)效關(guān)系，根據(jù)現(xiàn)有樣品中楊梅葉原花色素的質(zhì)量濃度，選擇其中質(zhì)量濃度較高的DPE組作為主要研究對(duì)象，測(cè)定其IC50并判定其抑制類型。

根據(jù)酶促反應(yīng)的機(jī)制，需基于米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（vmax）的測(cè)定來鑒別抑制劑抑制類別。Km表示的是酶促反應(yīng)速率達(dá)到vmax一半時(shí)的底物濃度，它能夠表示酶和底物的親和程度，是酶的特征常數(shù)之一。vmax表示的是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速率。根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定繪圖：在競(jìng)爭(zhēng)性抑制的酶促反應(yīng)過程中，當(dāng)抑制強(qiáng)度增大時(shí)，直觀地表現(xiàn)為抑制劑濃度的增大，Km值變大，vmax值不變；在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的酶促反應(yīng)過程中，當(dāng)抑制強(qiáng)度增大時(shí)，直觀地表現(xiàn)為抑制劑濃度的增大，Km值不變，vmax值減小。而抑制常數(shù)（Ki）被稱為酶-抑制劑復(fù)合物解離常數(shù)，是表現(xiàn)抑制劑與酶親和度的一個(gè)指標(biāo)，Ki值越小代表抑制劑與酶的結(jié)合越穩(wěn)定，從而說明其抑制能力越強(qiáng)。

選取不同的DPE質(zhì)量濃度（0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 mg/mL），分別在反應(yīng)1底物濃度[S1]（1 mmol/L）和反應(yīng)2底物濃度[S2]（2 mmol/L）條件下測(cè)定每分鐘反應(yīng)消耗底物的量，即反應(yīng)速率v，然后以DPE質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率v的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，繪制Dixon圖，得到Ki值。

選取不同的底物質(zhì)量濃度[S]（0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 mg/mL），分別在有DPE（質(zhì)量濃度為0.012 4 mg/mL）或無DPE的情況下測(cè)定反應(yīng)速率v。以[S]的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，v的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，繪制Lineweaver-Burk圖，得到Km值，檢驗(yàn)酶與抑制劑的結(jié)合穩(wěn)定性，并判定抑制類型。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量變化

表2 不同抑制劑對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（n＝8）Table 2 Effect of different inhibitors on body weight in SD rats (n= 8)g

圖1 抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)后SD大鼠體質(zhì)量變化情況Fig. 1 Body weight changes of SD rats after intervention with inhibitors

大鼠初始體質(zhì)量在140～150 g，造模成功的大鼠體質(zhì)量在325～356 g，高于普通飼料喂養(yǎng)的SD大鼠至少10%，具體變化見表2。不同組SD大鼠抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量變化情況如圖1。其中在50 d時(shí)體質(zhì)量下降是由解剖前一夜的空腹處理導(dǎo)致的。相對(duì)于高脂組，其他組體質(zhì)量增長(zhǎng)均較緩，但都呈現(xiàn)一個(gè)逐漸增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。從圖1中可以看出最終體質(zhì)量由大到小分別為HF組、LCB組、NF組、DPE組、Orlistat組、NDPE組，但由于初始體質(zhì)量的不同，體質(zhì)量增長(zhǎng)量的大小和最終體質(zhì)量排序有差異。

2.2 脂肪酶活力變化

圖2 不同抑制劑對(duì)胰脂肪酶的抑制率Fig. 2 Inhibition percentage of different inhibitors against pancreatic lipase

如圖2所示，由熒光強(qiáng)度計(jì)算得到的抑制率顯示：空白對(duì)照的抑制率為1.5%，基本沒有抑制作用；Orlistat的抑制率最大，達(dá)到了99.0%，且與其他抑制劑的差異顯著；LCB與NDPE差異不顯著，分別為83.2%和86.1%，與DPE差異顯著；DPE的抑制率為90.9%，與NDPE之間差異不顯著。

圖3 不同抑制劑對(duì)SD大鼠小腸胰脂肪酶活性的抑制率Fig. 3 Inhibition percentage of different inhibitors against pancreatic lipase in the small intestine of SD rats

由圖3可知，不同干預(yù)組之間的差異顯著，且干預(yù)組與NF組、HF組間差異顯著。NF組和HF組的抑制率分別為0.6%和1.0%，基本沒有抑制作用，而Orlistat組的抑制率最大，達(dá)到了96.5%，其次是DPE組、NDPE組和LCB組，分別為91.4%、83.9%和71.8%。其結(jié)果和體外酶活力測(cè)定結(jié)果相似。

2.3 磷脂酶A1活力變化

圖4 不同抑制劑對(duì)磷脂酶A1的抑制率Fig. 4 Inhibition percentage of different inhibitors against phospholipase A1

由圖4所示，以消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積計(jì)算得到抑制率，不同干預(yù)組與空白對(duì)照之間差異顯著，空白對(duì)照的抑制率為2.7%，基本沒有抑制效果。Orlistat與LCB的差異顯著（分別為97.1%和90.9%），NDPE、DPE的差異不顯著（分別為94.5%和96.7%）。LCB與NDPE之間差異不顯著，與DPE差異性顯著。

圖5 不同抑制劑對(duì)SD大鼠小腸磷脂酶A1活性的抑制率Fig. 5 Inhibition percentage of different inhibitors against phospholipase A1 in the small intestine of SD rats

由圖5可知，不同干預(yù)組之間的差異顯著，且干預(yù)組與NF組、HF組間差異顯著。NF組和HF組的抑制率分別為8.6%和2.7%，基本沒有抑制作用，而Orlistat組的抑制率最大，達(dá)到了97.2%，其次是DPE組、NDPE組和LCB組，分別為87.7%、77.3%和64.4%。其結(jié)果和體外酶活力測(cè)定結(jié)果相似。

2.4 IC50變化

圖6 DPE溶液質(zhì)量濃度對(duì)胰脂肪酶活性抑制的影響Fig. 6 Effect of DPE concentration on the activity of pancreatic lipase

設(shè)定底物濃度1 mmol/L，DPE溶液對(duì)酶促反應(yīng)的抑制效果以抑制率來表示。由圖6可以看出，DPE溶液質(zhì)量濃度從0 mg/mL到0.05 mg/mL增加時(shí)，抑制能力在逐漸增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度達(dá)到0.05 mg/mL以后，抑制能力達(dá)到最大進(jìn)而保持不變，得到DPE溶液對(duì)胰脂肪酶的IC50為0.01 mg/mL。同樣的方法對(duì)DPE溶液對(duì)磷脂酶A1活性抑制的影響作用作圖，如圖7所示，可知其IC50為0.06 mg/mL。

圖7 DPE溶液質(zhì)量濃度對(duì)磷脂酶A1活性抑制的影響Fig. 7 Effect of DPE concentration on the activity of phospholipase A1

2.5 抑制類型

圖8 DPE對(duì)胰脂肪酶反應(yīng)Dixon圖Fig. 8 Dixon plot of the inhibition of DPE against pancreatic lipase

圖8顯示的是DPE對(duì)胰脂肪酶反應(yīng)的Dixon圖，在[S1]為1 mmol/L和[S2]為2 mmol/L情況下所做的散點(diǎn)分別連線相交于第三象限的一點(diǎn)，該點(diǎn)的橫坐標(biāo)為-0.028，即Ki值為0.028 mg/mL，表明DPE與酶的結(jié)合很穩(wěn)定，其抑制作用屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制+反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的混合抑制類型。

圖9 DPE對(duì)磷脂酶A1反應(yīng)Dixon圖Fig. 9 Dixon plot of the inhibition of DPE against phospholipase A1

圖9顯示的是DPE對(duì)磷脂酶A1反應(yīng)的Dixon圖，在[S1]為1 mmol/L和[S2]為2 mmol/L情況下所做的散點(diǎn)分別連線相交于橫坐標(biāo)左側(cè)一點(diǎn)，該點(diǎn)的橫坐標(biāo)為-0.069，即Ki值為0.069 mg/mL，表明DPE與酶的結(jié)合很穩(wěn)定，其抑制類型屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖10 DPE對(duì)胰脂肪酶反應(yīng)Lineweaver-Burk圖Fig. 10 Lineweaver-Burk plot of pancreatic lipase inhibition by DPE

如圖10所示，無DPE散點(diǎn)圖連線與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)為6 812，有DPE散點(diǎn)圖連線與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)為3 572，說明其vmax分別為6 812 μmol/min和3 572 μmol/min，而有DPE散點(diǎn)圖連線交于橫坐標(biāo)上-4.1，得到Km值為0.25 mg/mL。

圖11 DPE對(duì)磷脂酶A1反應(yīng)的Lineweaver-Burk圖Fig. 11 Lineweaver-Burk plot of phospholipase A1 inhibition by DPE

如圖11所示，無DPE和有DPE散點(diǎn)圖連線交于縱坐標(biāo)上同一點(diǎn)4 871，有DPE散點(diǎn)圖連線交于橫坐標(biāo)上-11.1，得到Km值為0.09 mg/mL。

3 結(jié) 論

通過對(duì)LCB、NDPE、DPE以及Orlistat對(duì)胰脂肪酶和磷脂酶A1體外活性的影響做比較，得知DPE具有較好的抑制2 種酶活力的能力，其活性抑制能力稍低于Orlistat，在體外抑制磷脂酶A1的能力上甚至幾乎與Orlistat相同。通過對(duì)截取SD大鼠小腸進(jìn)行的腸道酶活力檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，楊梅葉原飛燕草素抑制體內(nèi)胰脂肪酶和磷脂酶A1活性的能力與體外實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)基本一致。測(cè)定了DPE對(duì)胰脂肪酶的IC50為0.01 mg/mL，其抑制類型根據(jù)Dixon圖判斷為競(jìng)爭(zhēng)性抑制+反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的混合抑制類型，根據(jù)Lineweaver-Burk圖發(fā)現(xiàn)vmax與Km值均發(fā)生變化，DPE參與反應(yīng)的Km值為0.25 mg/mL。測(cè)定了DPE對(duì)磷脂酶A1的IC50為0.06 mg/mL，其抑制類型根據(jù)Dixon圖判斷為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，根據(jù)Lineweaver-Burk圖發(fā)現(xiàn)vmax值不變，DPE參與反應(yīng)的Km值為0.09 mg/mL。DPE分別通過抑制胰脂肪酶和磷脂酶A1的活性影響脂肪的代謝，抑制能力能夠與Orlistat媲美。

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