煙草過氧化氫酶基因CAT2克隆與表達特征分析

侯含 王升平 張超群 等

摘 ?要：基于已有的植物Catalase 2基因（CAT2）序列設計煙草Nicotiana tabacum CAT2的特異性引物，通過RT-PCR擴增克隆獲得Nicotiana tabacum var. NC89 CAT2 全長mRNA序列，包含1479 bp完整的讀碼框（ORF），可編碼492個氨基酸殘基。遺傳進化分析顯示，煙草NC89 CAT2與N. benthamiana CAT2基因親緣關系最近。利用Quantitative Real-time PCR技術分析了CAT2基因在NC89煙草中的組織特異性表達和其應對生物和非生物脅迫的表達差異。結果表明，CAT2基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼、種子中均有表達，其中在花中相對表達量最高，其次為葉、莖、種子和根。生物和非生物脅迫處理煙株，其CAT2誘導表達分析顯示，機械損傷、滲透壓、低溫和高溫、干旱和感染PVY時CAT2表達量均上調(diào)。上述研究表明煙草CAT2基因可能參與了應對非生物和生物脅迫的過程。

關鍵詞：煙草;Catalase 2;非生物脅迫;生物脅迫

中圖分類號：S572.03 ?????????文章編號：1007-5119（2019）01-0001-08 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.001

Abstract： The full-length cDNA of Catalase 2 （CAT2） from Nicotiana tabacum var. NC89 was cloned usingspecific primers designed according to CAT2 mRNA sequences in other plants. Amino acid sequence alignment indicated that CAT2 contains a complete reading frame （ORF） of 1479 bp， which encodes 492 amino acid residues. Phylogenetic analysis showed that NC89 CAT2 shares high similarity with the CAT2 gene from N. benthamiana. Quantitative real-time PCR （qPCR） analysis revealed that CAT2 is highly expressed in petal and calyx， while less expressed in leaves， stems， seeds， and roots. The expression of NC89 CAT2 was enhanced by abiotic and biotic stressors， such as mechanical damage， osmotic pressure， low temperature， high temperature， drought and PVY infection. It was suggested that CAT2 plays an important role in growth， development， and interplay of abiotic and biotic stresses in plant.

Keywords： Nicotiana tabacum; Catalase2; abiotic stress; biotic stress

過氧化氫酶（Catalase，CAT）又稱觸酶，是第一個被發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶，LOEW[1]將其命名為Catalase，其廣泛存在于能呼吸的生物體內(nèi)，在植物體內(nèi)主要存在于葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而在動物體內(nèi)主要存在于肝和紅細胞中。

CATs與SOD、POD、ASP一起被稱為酶保護

基金項目：江西省煙草公司科技項目“江西煙草病毒病綠色防控技術研究與應用”（201701002）;四川省煙草公司科技項目“煙草病毒病快速檢測技術的開發(fā)與應用”（SCYC201804）;廣西壯族自治區(qū)煙草公司科技項目“廣西煙草綠色防控重大專項技術研究與推廣應用”（201745000024095）;湖南省煙草公司科技項目“湖南煙區(qū)主要病毒病防控關鍵技術研究”（201743010020088）

作者簡介：侯 ?含（1991-），女，研究生，研究方向：分子植物病理學。E-mail：angelichh@163.com。*通信作者，E-mail：yangjinguang@caas.cn

收稿日期：2018-07-17 ?????????????????修回日期：2018-10-19

系統(tǒng)[2]，其主要功能是將過氧化氫分解為水和氧氣，從而清除植物光呼吸、脂肪酸β氧化和線粒體電子傳遞等過程中產(chǎn)生的H2O2，在植物防御、脅迫應答、控制細胞的氧化還原平衡和延緩衰老等方面起著重要作用[3]。前人已有研究，增強植物體內(nèi)抗氧化酶活性和抗氧化代謝水平可以提高植物本身的抗逆性[4-5]。在植物體內(nèi)，CATs家族由多基因編碼，其表達隨時空的不同而變化，也受到干旱、重金屬、高鹽、溫度、光照等非生物因子和病原等生物因子的雙重影響[6]。

本研究基于已經(jīng)報道的CAT2基因的序列，對煙草NC89（Nicotiana tabacum var. NC89）CAT2基因進行了克隆和表達分析，揭示了煙草CAT2基因在植物應對生物脅迫和非生物脅迫中的功能，為深入研究植物的抗病和抗逆機制提供重要理論依據(jù);同時利用基因工程技術，為提高植物對各種脅迫的適應能力和改善生態(tài)環(huán)境提供新的思路。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

煙草材料及毒源：NC89、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）毒源為中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所保存。除特別注明，煙草材料在25 ℃，14 h光照/10 h黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2 ?研究地點與方法

1.2.1 ?試驗地點 ?中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所氣候室。

1.2.2 ?培養(yǎng)方法 ?藥品材料：LB固體和液體培養(yǎng)基;RNA提取試劑盒，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，pEASY-T1載體，大腸桿菌DH5α購于青島群昌科貿(mào)有限公司（TRANS）;dNTP Mixture，Taq酶，Loading buffer，DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）;氨芐青霉素鈉鹽購自上海生工生物工程技術服務有限公司。引物合成由寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）完成。

1.2.3 ?總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄 ?將煙草組織采集后

放入液氮中速凍并轉(zhuǎn)入?80 ℃超低溫冰箱保存。不同組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA參照試劑盒說明書，引物為通用引物OligdT18。

1.2.4 ?克隆、鑒定及測序 ?PCR擴增體系：cDNA 1 μL、引物各2 μL、10×Trans Taq HiFi Buffer Ⅱ 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、Trans Taq TMHiFi DNA Polymerase 1 μL、ddH2O 35 μL，總體積為50 μL。擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳后，按凝膠回收試劑盒的說明，回收得到的目的DNA片段，并連接到載體pEASY-T1上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α上，對獲得的陽性克隆進行測序（由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測定）。

1.2.5 ?樣品預處理 ?不同組織：分別取正常生長條件下成熟煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼和種子。

機械損傷：對NC89從上往下第2片葉進行針刺傷害處理，每片葉針刺50次，4、8、12、16 h 后分別取材，以正常生長為對照。

滲透壓：采用250 mmol/L NaCl噴施葉面處理2、4、6、8、10 h，取上部第2片葉，以清水處理為對照。

溫度處理：以25 ℃處理為對照，在4 ℃和40 ℃環(huán)境下培養(yǎng)NC89幼苗，分別于4、8、12、16 h取上部第2片葉，以相同溫度的清水澆灌。

干旱處理：于消除澆水1、3、5、7 d采集上部第2片葉，以正常澆水為對照。

紫外處理：紫外照射2、4、6、8、10 h，采集上部第2片葉片，以正常條件下葉片作對照。

接毒處理：NC89接種PVY病毒24、48和72 h后取上部第2片葉，以清水處理為對照。

每個處理3次生物重復，處理后取樣研磨分裝保存，置于?80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 ?Quantitative real-time PCR對表達差異的分析 ?提取各處理樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)克隆獲得的煙草CAT基因序列，通過Primer軟件進行Quantitative real-time PCR特異性引物設計[7]，然后利用Oligo 6.0軟件和在線數(shù)據(jù)庫Oligo

Calc（http：//www.basic.northwestern.edu/biotools/ oligocalc.html）對所設計的引物進行評價，并通過在線BLSAT程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）進行驗證，以避免引物序列與煙草基因組其他序列同源。引物為CAT2-F、CAT2-R、18sF、18sR，其中18s rRNA為內(nèi)參基因（表1）。Quantitative real-time PCR反應在AB7500（Applied Biosystems 7500 Real-time）PCR儀進行，反應體系的配制均按TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行。測定值用平均值加標準差表示，采用CT值來比較各基因的相對表達量，目的基因相對表達量用目的基因mRNA表達水平比內(nèi)參基因mRNA表達水平的相對倍數(shù)來表示，分析CAT2基因在不同組織、非生物和生物脅迫下表達差異。

2 ?結 ?果

2.1 ?基因克隆及序列分析

根據(jù)GenBank中已有的植物CAT2基因序列設計一對煙草CAT2的特異性引物（CAT2F、CAT2R），通過煙草葉片的總RNA提取，PCR擴增和測序，獲取片段為1489 bp（圖1），其序列如下：

通過NCBI的ORF finder軟件對CAT2全長cDNA序列進行分析，其中包含1479 bp完整的讀

碼框（ORF），可編碼492個氨基酸殘基。經(jīng)過ExPASy網(wǎng)站ProtParam在線工具分析（http：//www. expasy. org/proteomics）預測NC89 CAT2分子量為56.41 kDa，等電點（pI）為6.87。

利用MEGA 4.0軟件通過Neighbor-Joining（N-J鄰接法）對已確定不同物種的CAT序列與NC89的CAT2序列進行比對構建系統(tǒng)進化樹（圖2）。在選取的13個物種中，明顯分為3大類。水稻、小麥、玉米和大豆分為一簇;普通煙草、辣椒、番茄和擬南芥分為一簇;NC89、白花單葉煙草、茄子、龍葵和馬鈴薯分為另一大簇，而在這一簇中茄子單獨一組，馬鈴薯和龍葵一組，而NC89和白花單葉煙草一組親緣性關系較近。

2.2 ?不同器官表達特異性分析

煙草NC89不同組織CAT2基因表達量分析顯示（圖3），CAT2基因在煙草NC89的根、莖、葉、

花瓣、花萼、種子中均有表達，但是不同組織間存在較大的差異。CAT2基因在根組織表達量最低，花萼組織中表達量最高，約是根組織的585 000倍，其次是花瓣，約是根組織的74 990倍，而葉組織中表達量約是根組織的7250倍，莖和種子組織表達量也很低與根組織表達量相近。

2.3 ?CAT2脅迫表達分析

為檢測CAT2基因在植物抗逆過程中的作用，對NC89煙苗在生物脅迫和非生物脅迫條件下基因表達水平進行了qPCR分析（圖4），可知機械損傷4 h后，CAT2基因表達量較對照已有增長;處理8、12 h后CAT2基因表達量升高，分別為對照的11倍、15倍;在機械損傷處理16 h后表達量是對照的45倍。

NaCl處理2 h后CAT2基因的表達量與對照相近;處理4 h后CAT2的表達量增長至對照的2倍;處理6 h后CAT2表達量為對照的60倍。處理8 h、10 h后CAT2基因的相對表達量明顯下降，與對照基本持平。

在低溫（4 ℃）脅迫4 h時CAT2基因的相對表達量達到較高值為對照的8倍;處理8 h后CAT2的表達量降低為對照的3倍;在處理后12 h、16 h出現(xiàn)其表達量明顯下降，并在16 h后達到最低值。

高溫（40 ℃）脅迫4 h后，CAT2基因相對表達量與對照基本相同;CAT2在高溫處理8 h后表達量為對照的2750倍;CAT2在處理12 h和16 h后基因相對表達量分別降低為對照的240倍、1550倍。

干旱處理1 d后CAT2基因表達量達到高峰，為對照的7倍;處理3 d后表達量降低至與對照持平，而處理5 d、7 d后CAT2的表達量與對照一致。

紫外處理2 h、4 h時CAT2基因表達量低于對照;處理6 h后，CAT2表達量開始增長與對照持平;處理8 h后CAT2基因表達量出現(xiàn)明顯增長，達到對照的5000倍;處理10 h后CAT2達到高峰為對照的6000倍。

接種PVY 24 h后（圖5）CAT2基因相對表達量增長至對照的44倍;處理48 h后CAT2的表達量上升為對照的1035倍;處理72 h其表達量下降至與對照持平。

3 ?討 ?論

CAT基因家族由多基因編碼，曾在煙草、擬南芥、玉米、南瓜和大米等被子植物中發(fā)現(xiàn)3種過氧化氫酶[8-12]。本研究從N. tabacum var. NC89葉片成功克隆獲得CAT2基因的cDNA序列，對全長cDNA序列進行預測分析發(fā)現(xiàn)NC89 CAT2有1479 bp完整的讀碼框（ORF），可編碼492個氨基酸;預測分子質(zhì)量為56.41 kDa，等電點（pI）為6.87。通過Neighbor-Joiniing（N-J鄰接法）NC89和白花單葉煙草的CAT2同源性高。

已有研究表明，CAT2基因家族的表達具有組織和器官特異性。在正常生長條件下，CAT2在發(fā)芽后的盾片表達豐富，而在葉片和上胚軸表達量較低[13];在南瓜中，CAT2在綠色子葉、成熟葉、莖和綠色胚軸都有表達[8]。擬南芥CAT2在花序和種子內(nèi)都表達[14]。本研究結果為CAT2基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼、種子中都有表達，而CAT2在花萼組織中表達量最高，花瓣和葉片次之，在根、莖、種子中表達量較低，其中根組織表達量最低。本研究結果表明，NC89 CAT2基因的表達具有組織和器官特異性，CAT2在葉、花瓣、花萼中表達量豐富，可能與植物地上部的光呼吸產(chǎn)生的H2O2清除有關，而對于地下部的光呼吸產(chǎn)生的H2O2清除則可能與其他同源基因的表達有關。

機械損傷脅迫可以顯著提高CAT2表達量。在玉米未成熟的種子中，機械損傷處理能夠誘導提高3種CAT基因表達量;而在成熟葉片中，僅有CAT1和CAT3表達量提高，都在處理12 h后表達量顯著提高，CAT基因參與了玉米對損傷的適應[15]。JUNG等[16]研究表明，Norflurazon （NF）誘導玉米CAT2轉(zhuǎn)錄水平的提高主要發(fā)生在葉內(nèi)，而在盾片中無明顯變化。本研究中，NC89在遭受機械損傷時，CAT2基因家族表達量變化與玉米的CAT2基因表達趨勢一致。CAT2在16 h表達量達到最高，從而推測NC89在遭受機械損傷時，CAT2基因與玉米CAT2有同樣的功能，與機械損傷過程中H2O2的清除有關。

滲透壓處理提高CAT2基因的相對表達量。在鹽脅迫條件下大麥等植物體內(nèi)CAT的活性明顯增加[17]，暗示H2O2可能在植物鹽脅迫調(diào)節(jié)過程中起作用，調(diào)節(jié)CAT基因的表達。但在高鹽（400 mmol/L）脅迫下，Bruguiera parviflora的CAT活性下降的同時，伴隨著POX和GR活性的增強[18]。本研究中，鹽脅迫能夠提高NC89 CAT2基因表達量，清除高鹽脅迫下產(chǎn)生的H2O2，從而參與高鹽脅迫的適應。進而推測CAT2基因隨著高鹽脅迫時間和濃度的變化，其活性也會有不同的變化，同時還可能伴隨著其他抗氧化酶的變化。

低溫和高溫處理可誘導CAT2基因的表達量提高。擬南芥隨著冷馴化時間的延長，葉綠體基質(zhì)中CAT2的含量都有不同程度地增加[19]，線粒體中富含甘氨酸的RNA結合蛋白（GRP2）通過調(diào)節(jié)CAT等酶的活性而提高了擬南芥對冷害和凍害脅迫忍耐能力[20]。FARIDUDDIN等[21]發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫導致番茄產(chǎn)量降低，而耐熱品種比熱敏感品種產(chǎn)量降低少，在耐熱品種中CAT酶活性都明顯增加。本研究結果與前人研究一致。從而推測，通過提高CAT酶活性能夠顯著增強植物低溫脅迫耐受性。而在高溫脅迫過程中，CAT2基因表達量提高說明CAT2基因可能在夏季高溫天氣適應過程中發(fā)揮著重要作用。

干旱脅迫能夠誘導NC89 CAT表達量提高。樟樹具有較強的抗旱能力和傷害修復及超補償能力，在干旱脅迫條件下樟樹CAT活性顯著增加[22]?？购敌詮姷挠衩灼贩N，其SOD、CAT、GPX等酶活性較高，研究發(fā)現(xiàn)玉米抗旱性與水分脅迫下CAT等保護酶活性呈顯著正相關[23]。小麥中CAT2的表達量在受到嚴重干旱時表達量顯著增強[24]。本研究表明在NC89遭受干旱脅迫時，CAT2基因的表達量提高，因此我們推測其在適應干旱條件有著重要作用。

紫外脅迫能夠引起CAT基因表達量的變化。在N. plumbaginifolia L.上的研究表明3種CAT基因在受到55 MJ/m2強度的紫外線影響下，表達量變化是不一樣的，CAT1基因的表達量受到抑制，而CAT2和CAT3基因能夠誘導的表達[25-26]。而有研究表明在胡蘿卜中，CAT2基因在紫外處理6 h后能夠誘導表達[27]。反義表達CAT的轉(zhuǎn)基因煙草增強了煙草對光的敏感性，葉片在中等光強下即產(chǎn)生壞死斑，光合能力受到抑制[28]。本研究CAT2基因表達量變化，可推測在紫外光脅迫下可能引起NC89葉片光合作用的光失活，而CAT1基因表達受到光抑制，而此時NC89體內(nèi)H2O2的清除可能由CAT2基因發(fā)揮作用。

接種PVY處理提高了CAT2基因的相對表達量[29]。陳學平等[30]研究感染TMV煙草結果表明，抗病品種CAT活力值在處理后與感病品種相比明顯低;吳元華等[31]對感病煙草品種NC89接種PVY進行研究，僅在接種后第2天CAT活性比對照略有升高，而后均比對照低，在第6天和第10天CAT活性降低的幅度較大。研究結果表明，敏感植株在接種病毒后前5 d CAT酶活性升高，隨后降低。而本研究中隨接種PVY時間的變化，NC89 CAT2基因的表達量先上升后下降，處于表達量上調(diào)的過程，從而推測其在抗PVY侵染過程中CAT2基因有著重要的作用。

4 ?結 ?論

本研究對煙草NC89 CAT2基因初步進行了定量實驗，分析了其在不同器官的表達量及生物脅迫、非生物脅迫處理下的表達量差異。通過機械損傷、滲透壓、低溫、高溫、干旱、紫外因子和感染PVY等方法處理并檢測CAT2基因表達量的變化，結果顯示生物脅迫與非生物脅迫均引起CAT2基因表達

量上調(diào);不同器官（花、葉、根、莖、種子）基因表達量有差異性，其中CAT2基因在花中的表達量最高，在根中的表達量最低。這暗示CAT2基因可能參與了應對脅迫的過程，為深入地研究植物的抗逆機制及利用基因工程技術提高植物對逆境的適應能力和改善生態(tài)環(huán)境提供了重要理論依據(jù)。

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