PLA/PCL—PANI復(fù)合納米纖維膜的制備及性能研究

王新 駱菁菁 熊杰

摘要：利用靜電紡絲技術(shù)，制備了聚苯胺摻雜的聚乳酸/聚己內(nèi)酯復(fù)合導(dǎo)電納米纖維膜，通過掃描電鏡（SEM），探討了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比下的聚苯胺對纖維膜相關(guān)性能和纖維表面形貌的影響，并采用紅外光譜分析（FTIR）、X射線衍射（XRD）和熱重分析法（DSC）等測試手段對纖維膜的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，具有一定形貌和電導(dǎo)性的PANI復(fù)合納米纖維支架，對細(xì)胞在纖維上的吸附和增殖有一定的促進(jìn)作用，具有良好的生物相容性，作為生物支架材料在組織工程上具有一定的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：聚苯胺;聚乳酸;聚己內(nèi)酯;導(dǎo)電性;表面形貌;組織工程

中圖分類號：TQ342.94

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1009-265X（2019）01-0001-05

細(xì)胞和材料之間的相互作用是組織工程中的關(guān)鍵性問題，支架材料本身的物理化學(xué)性質(zhì)直接影響細(xì)胞的行為[1]。數(shù)十年來，研究人員通過改變不同物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，包括材料的化學(xué)組成、潤濕能力和表面形態(tài)等，來調(diào)控細(xì)胞和材料之間的相互作用[2]。支架材料的結(jié)構(gòu)和形貌控制著再生組織的結(jié)構(gòu)、尺寸和形貌，作為連接細(xì)胞和組織的框架，引導(dǎo)組織生長成特定形態(tài)[3]。因此，設(shè)計具有適合特定組織類型特征的支架對于實現(xiàn)組織的再生至關(guān)重要。原生組織中的細(xì)胞被細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）包圍，因此模仿ECM的特征有利于組織再生[4]。納米纖維形態(tài)被認(rèn)為是ECM的主要結(jié)構(gòu)特征之一。在眾多制備納米纖維的方法中，靜電紡技術(shù)具有大尺度的加工，容易控制纖維直徑或形貌等優(yōu)點(diǎn)[5]。此外，導(dǎo)電聚合物近年來受到了廣泛關(guān)注，研究表明電刺激或物質(zhì)的電活動會影響細(xì)胞行為[6]。導(dǎo)電聚合物如聚吡咯（PPY）和聚苯胺（PANI）可促進(jìn)神經(jīng)元的生長和分化，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的吸附和增殖[7]，在體外和體內(nèi)都具有良好的生物相容性[8]。纖維膜的特性影響著細(xì)胞的增殖和分化[9]，本文制備了一種具有特殊形貌和電導(dǎo)性的PLA/PCL—PANI復(fù)合納米纖維膜，研究這些性質(zhì)對細(xì)胞行為的影響。

1實驗

1.1材料

聚乳酸（PLA，Mn=150 000），聚己內(nèi)酯（PCL，Mn=80 000）深圳光華偉業(yè)有限公司;六氟異丙醇（HFIP，分析純，鹽城冬陽生物制品有限公司）;聚苯胺（PANI，Mn=65 000），樟腦磺酸（CPSA）美國sigma公司。

1.2溶液的配制

稱取一定量的PLA和PCL（4∶1w/w）溶解在HFIP中，在室溫條件下，使用磁力攪拌器攪拌24 h，獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的PLA/PCL混合溶液。稱取相同質(zhì)量的PANI（Mn=65 000 g/mol）和CPSA將其溶解在HFIP中，水浴超聲處理1 h后，在室溫條件下，使用磁力攪拌器攪拌24 h，使用孔徑為0.45 μm的注射器式的過濾器進(jìn)行過濾，得到墨綠色溶液。將上述配置的兩種溶液以一定比例混合，最終得到PLA/PCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%混合溶液（其中PANI的含量為1%），以同樣方式分別配置PANI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%和3%的混合溶液。

1.3PLA/PCL—PANI復(fù)合納米纖維膜的制備

將上述配置的溶液添加到注射器中，在接收距離為13 cm、紡絲電壓為12 kV、溶液流速為0.60 mL/h、相對濕度為30%～40%、室溫的紡絲條件下進(jìn)行紡絲，得到復(fù)合納米纖維膜，將其放在真空干燥箱中干燥24 h。

2PLA/PCL—PANI復(fù)合納米纖維膜的表征

通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE—SEM）（S4800，日本）觀察復(fù)合納米纖維的形貌，樣品被鍍金60 s后觀察以增加纖維形貌的清晰度;靜電紡納米纖維膜的直徑通過圖片分析軟件（Image—J software）進(jìn)行分析。靜電紡納米纖維膜的潤濕性通過水接觸角進(jìn)行測試，液滴的大小為0.5 μL，同一個樣品在相同間距下對多個點(diǎn)進(jìn)行測試求取水接觸角的標(biāo)準(zhǔn)偏差;用傅里葉紅外交換光譜儀（ATR—FTIR）檢測纖維膜化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，采用溴化鉀壓片，光譜范圍為4 000～400 cm-1。使用差示掃描量熱儀（DSC）（Q20，美國）對復(fù)合納米纖維膜的熱力學(xué)性能進(jìn)行分析，升溫速率為10 ℃/min，升溫范圍為20～200 ℃。采用X射線衍射儀（XRD）（D8 discover，美國）對復(fù)合納米纖維膜的結(jié)晶度進(jìn)行檢測，掃描范圍為10°～45°，掃描速度為2°/min。用紫外可見光光度計（UV—VIS）對PLA/PCL—PANI納米纖維膜的光學(xué)性能進(jìn)行檢測，根據(jù)吸收譜上的某些特征波長處的吸光度的高低來判別或測定該物質(zhì)的含量，測定的波長范圍為190～1 100 nm。電導(dǎo)性測試則通過循環(huán)伏安法進(jìn)行測試。細(xì)胞增殖測試（MTT分析法）是將制備好的纖維膜裁剪成直徑為10 mm的圓，放置在96孔板中。接種小鼠胚胎成骨細(xì)胞（NIH—3T3）前，用70%的乙醇浸泡4 h，然后用無菌的PBS反復(fù)漂洗3次。使用70%的乙醇溶液對PLA/PCL—PANI復(fù)合納米纖維膜進(jìn)行消毒。具體步驟如下：用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔5×103個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μL。培養(yǎng)1，4，7 d后，每孔加MTT溶液（5 mg/ml PBS）20 μL。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

3結(jié)果與討論

3.1PLA/PCL和PLA/PCL—PANI復(fù)合納米纖維膜的形貌分析

圖1中顯示了在相對濕度為40%，不同PANI含量下制得復(fù)合納米纖維膜的電鏡圖片，其中a、b、c、d分別代表PANI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，1%，2%，3%的納米纖維，在這里分別用PLA/PCL、PLA/PCL—PANI（1%）、PLA/PCL—PANI（2%）、PLA/PCL—PANI（3%）代替不同PANI含量下的納米纖維。圖1可以觀察到PLA/PCL、PLA/PCL—PANI（2%）納米纖維表面有密集的溝槽出現(xiàn)，可能是因為非溶劑誘導(dǎo)溶液相分離，即空氣中的水蒸氣與射流溶液中的溶劑混合，起到非溶劑的作用，引起溶液發(fā)生液—液相分離，形成聚合物富集相和溶劑富集相[10]。而溶劑揮發(fā)過程中，射流隨之固化，溶劑富集相形成孔道，聚合物富集相形成纖維骨架，從而形成的纖維具有褶皺的表面，且表面具有縱向的溝槽和凸起的棱，纖維內(nèi)部為實心結(jié)構(gòu)。

靜電紡納米纖維的直徑受到聚合物溶液的濃度、溶液的電導(dǎo)率、流率和電壓等多種因素影響。圖2觀察到納米纖維的直徑隨著PANI含量的增加而逐漸減小，可能是因為溶液電導(dǎo)率的增加。從直徑頻率分布曲線可以看出，PLA/PCL和PLA/PCL—PANI（2%）下納米纖維直徑分布的比較分散，而PLA/PCL—PANI（1%）和PLA/PCL—PANI（3%）中納米纖維的直徑分布相對比較集中，納米纖維的平均直徑隨著PANI含量的增加而逐漸減小。

3.2FTIR光譜分析

從圖3中可以看出，曲線d在3 436 cm-1對應(yīng)是—OH，—NH的伸縮振動吸收峰。其中以分子中氫鍵為主，然而通過比較可以發(fā)現(xiàn)，曲線b，c，d在此處的吸收峰的峰寬和峰面積隨著聚合物中PANI含量的增加而增加。在3 100～3 000 cm-1對應(yīng)著芳環(huán)上C—H伸縮振動，3 000～2 700 cm-1對應(yīng)著飽和C—H伸縮振動吸收。曲線c中波數(shù)2 335 cm-1，1 759 cm-1，1 462 cm-1，1 350 cm-1分別對應(yīng)著PANI，PLA和PCL中的CN伸縮振動，CO伸縮振動，C—H面內(nèi)彎曲振動，C—N伸縮振動吸收。而1 184 cm-1和1 087 cm-1則對應(yīng)著PLA和PCL中的C—O伸縮振動及對稱振動的特征吸收峰。曲線d所表示的PANI復(fù)合納米纖維的紅外光譜上，除了含有曲線a的特征峰外，PANI所具有的特征峰也存在，這說明經(jīng)摻雜后的復(fù)合纖維和PANI是共混體系。此外，除了上述PLA，PCL和PANI的特征峰外，曲線d中沒有其他特征峰的出現(xiàn)，這說明PANI在添加過程中并未與聚合物及溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，復(fù)合纖維的分子鏈未發(fā)生變化。

3.3DSC表征

圖4DSC分析譜圖顯示了3個特征峰，分別是共混物中PCL位于58 ℃的熔融峰（Tm）和PLA在96.6 ℃處的結(jié)晶峰（Tc），以及PLA位于152 ℃的熔融峰（Tm）。在添加PANI后熔融峰位置幾乎沒有發(fā)生改變，熔融峰的峰寬卻隨著PANI含量的增加而增加。兩個熔融峰的存在，以及峰寬的增加都能夠說明PLA和PCL間是不相容的。結(jié)晶峰的峰位置發(fā)生了明顯的位移，相比較PLA/PCL添加了PANI后PLA更容易結(jié)晶。PLA作為一種半結(jié)晶聚合物，其峰的位移和結(jié)晶度的增大，這是由于PANI和少量的PCL作為異相成核劑使得PLA的分子鏈，能夠依附于殘留在熔體中粗糙的雜質(zhì)表面有序排列，PANI中氨基基團(tuán)與熔體分子中的羥基產(chǎn)生的分子間氫鍵，也有助于結(jié)晶的生成，使得PLA相能夠快速成核結(jié)晶。

3.4XRD圖譜分析

圖5為純的PLA/PCL和不同PANI含量下的PLA/PCL—PANI復(fù)合納米纖維膜的XRD圖譜，從圖5中可以看出PLA作為一類結(jié)構(gòu)無序度高的能量介穩(wěn)態(tài)半結(jié)晶聚合物，在衍射角為14.20°和24.42°處分別出現(xiàn)了不是很尖銳的峰包和比較明銳的衍射峰，這也說明了PANI誘導(dǎo)后形成的聚乳酸晶體主要是α晶型。加入PANI后復(fù)合體系衍射峰位置與純PLA/PCL相比無明顯偏移，且沒有新的衍射峰出現(xiàn)，這說明PANI并不會誘導(dǎo)PLA/PCL出現(xiàn)新的晶型，但少量的PANI卻能起到很好的異相成核作用，誘導(dǎo)PLA形成了大量的晶體。這是由于當(dāng)PANI的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時，少量的PANI可以充當(dāng)成核劑，起到異相成核的作用，誘導(dǎo)無定形的PLA進(jìn)行結(jié)晶。但當(dāng)PNAI的含量增大時，有較強(qiáng)運(yùn)動能力的PANI鏈段自身會先聚集在一起，規(guī)整排列形成較大體積的晶核，這時PANI晶核的比表面積相比于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時的有所下降，PLA和PANI的相對接觸面積減小，溶液中只有少量的PLA可以圍繞PANI晶核進(jìn)行生長，其余大部分的PLA分子鏈依然處于無序狀態(tài)。因此可以看出少量的PANI對PLA結(jié)晶有促進(jìn)作用，但隨著PANI含量的增加PLA結(jié)晶將受到影響。

3.5UV—VIS分析

在紫外可見光譜圖中（圖6），PLA—PCL紫外吸收曲線并沒有特征的吸收峰，吸收強(qiáng)度沿長波方向沒什么變化，對光呈透過性。PANI復(fù)合納米纖維膜在200～1 000 nm波長范圍內(nèi)則有明顯的吸收峰，在203 nm處的E2帶，中等強(qiáng)度吸收是由苯環(huán)的共軛二烯所引起，又稱K帶;K帶是由共軛體系的π→π*躍遷產(chǎn)生的，躍遷所需要的能量較R吸收帶要大，K吸收帶是共軛分子的特征吸收帶，PANI含有苯環(huán)和苯醌，分子有共軛CC，CN雙鍵，二者都能夠吸收紫外光或可見光的發(fā)色團(tuán);B帶也是苯環(huán)上3個雙鍵共軛體系中的π電子向π*反鍵軌道躍遷和苯環(huán)的振動相重疊引起的，但相對來說，該吸收帶強(qiáng)度較弱。芳香族化合物的特征吸收帶，一般在230～270 nm之間出現(xiàn)精細(xì)的結(jié)構(gòu)吸收，又稱苯的多重吸收。之所以在321→451 nm間觀察到紫外的特征吸收帶，首先這是因為作為發(fā)色團(tuán)的CC雙鍵在PANI摻雜后形成的助色基團(tuán)的作用下，可以使生色基團(tuán)吸收波長變長，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)。助色基團(tuán)中的n電子可以產(chǎn)生P-π共軛，使π→π*躍遷能量降低，因而使吸收波向長波方向移動，發(fā)生所謂的紅移;其次是因為苯醌結(jié)構(gòu)含有CC，CN雙鍵，兩個生色基團(tuán)相互影響，且隨著共軛體系的增長，其最大吸收峰移向長波方向甚至可達(dá)到可見光區(qū)域，隨著波長的紅移，吸收強(qiáng)度也增大。因此，E帶和B帶都發(fā)生了紅移，出現(xiàn)了譜圖中觀察到的現(xiàn)象。

3.6納米纖維膜潤濕性能分析

從PANI復(fù)合納米纖維膜的水接觸角變化趨勢圖7可以看出，納米纖維膜的水接觸角隨著PANI含量的增加而減小，潤濕性能逐漸增強(qiáng);而在PANI3時水接觸角減少的趨勢減緩，這是由于對于一定的固體表面，在液相中加入表面活性物質(zhì)?？筛纳茲櫇裥阅埽⑶译S著液體和固體表面接觸時間的延長，接觸角有逐漸變小趨于定值的趨勢。PANI容易團(tuán)聚從而使納米纖維膜的粗糙程度增加，潤濕性能減弱。

3.7納米纖維膜的電導(dǎo)性分析

本征態(tài)聚苯胺是藍(lán)色的，處于中間氧化態(tài)，它本身不導(dǎo)電;然而經(jīng)過樟腦磺酸摻雜之后，得到了一種呈墨綠色的聚苯胺，是處于中間氧化態(tài)和全還原態(tài)之間的一種特殊的狀態(tài)，這種摻雜態(tài)即是我們所熟知的具有一定導(dǎo)電性的聚苯胺。聚苯胺有較高的電導(dǎo)率，但聚苯胺在普通溶劑中溶解性很差，可選擇的溶劑也很少，且隨著聚苯胺在混合溶液中含量的增加，溶液的可紡性也變得很差。圖8中可以看出隨著PANI含量的增加，電導(dǎo)率逐漸增加。

a.PLA/PCLb.PLA/PCL—PANI（1%）c.PLA/PCL—PANI（2%）d.PLA/PCL—PANI（3%）圖8納米纖維膜的電導(dǎo)率測試

3.8細(xì)胞增殖分析（MTT分析）

通過MTT法檢測PLA/PCL—PANI復(fù)合納米纖維膜的生物性能，檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來間接反映活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。從圖9中可以看出，不同含量的PANI復(fù)合納米纖維組與PLA/PCL組及細(xì)胞培養(yǎng)板組相比，細(xì)胞在PANI復(fù)合納米纖維膜未顯示出細(xì)胞毒性，隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞在不同含量的PANI復(fù)合納米纖維膜上能夠很好的增殖，且細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間的增加而逐漸增加。與其他組份相比較，在復(fù)合納米纖維膜PANI2上細(xì)胞增殖的數(shù)量的尤其明顯。

4結(jié)論

a）通過DSC和XRD熱力學(xué)測試結(jié)果表明PANI并不會誘導(dǎo)PLA/PCL出現(xiàn)新的晶型，但少量的PANI卻能起到很好的異相成核作用。

b）通過FTIR和UV—vis測試進(jìn)一步表征經(jīng)樟腦磺酸摻雜后PANI官能團(tuán)的變化，發(fā)現(xiàn)PLA—PCL納米纖維膜的紫外吸收曲線并沒有特征的吸收峰，吸收強(qiáng)度沿長波方向沒什么變化，對吸收光呈透過性。隨著PANI含量的增加，其最大吸收峰移向長波方向甚至可達(dá)到可見光區(qū)域，隨著波長的紅移，吸收強(qiáng)度也逐漸增大。

c）通過MTT、SEM、水接觸角測試說明具有一定形貌和電導(dǎo)性的PANI復(fù)合納米纖維膜能夠很好地促進(jìn)細(xì)胞的吸附和增殖，在細(xì)胞支架應(yīng)用領(lǐng)域具有一定的前景。

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