藏藥七十味珍珠丸灌胃給予腦缺血再灌注損傷模型大鼠的量—時—效關系研究

梁源 付珂 王張 孫位軍 徐文龍 賈曉靜 胥培艷 陳璐

中圖分類號 R285.5；R931.71 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0094-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.20

摘 要 目的：研究七十味珍珠丸治療大鼠腦缺血再灌注損傷的量-時-效關系。方法：將大鼠隨機分為假手術組（生理鹽水，10 mL/kg）、模型對照組（生理鹽水，10 mL/kg）、陽性對照組（尼莫地平，30 mg/kg）、七十味珍珠丸不同劑量組（0.52、1.04、2.08、4.17、8.33、16.67、33.34、66.68、133.36、266.72、533.44 mg/kg），每組18只，各組大鼠灌胃相應藥物1次；灌胃25 min后，除假手術組外，其余各組大鼠均用線栓法制造腦缺血再灌注損傷模型。腦缺血24、48、72 h后，對各組大鼠進行神經(jīng)行為學評級，檢測大鼠腦梗死率以評價腦缺血各時段七十味珍珠丸的最佳有效時間點、最佳給藥劑量（Dmax）和最大效應（最小腦梗死率，Emax），然后采用Thermo Kinetica 5.1軟件對七十味珍珠丸給藥劑量與腦梗死率進行量-時-效關系擬合，計算量效曲線下面積（AUClast）、滯留劑量（MRTlast）；并檢測各組大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠神經(jīng)行為顯著異常（P<0.05或P<0.01），腦梗死率明顯增加（P<0.01），大鼠血清中SOD水平顯著降低（P<0.01，48 h），MDA水平顯著升高（P<0.05，48 h）。與模型對照組比較，尼莫地平組神經(jīng)行為異常無顯著變化（P>0.05），腦梗死率顯著降低（P<0.01，24、48 h），大鼠血清中SOD水平顯著升高（P<0.01，48 h），MDA水平顯著降低（P<0.05，48 h）；七十味珍珠丸2.08～33.34 mg/kg 劑量組神經(jīng)行為異常顯著改善（P<0.05，24 h）；腦缺血24 h，七十味珍珠丸4.17～133.36 mg/kg劑量組腦梗死率均顯著降低（以33.34 mg/kg劑量組最低，P<0.05或P<0.01），33.34～533.44 mg/kg劑量組大鼠血清中SOD水平均顯著升高（P<0.05），0.52～2.08、8.33、33.34、266.72、533.44 mg/kg劑量組MDA水平均顯著降低（P<0.05），Dmax為33.34 mg/kg、Emax為3.02%、AUClast為5 141.76 mg/kg、MRTlast為329.161 mg/kg；腦缺血48 h，七十味珍珠丸2.08～133.36 mg/kg劑量組腦梗死率均顯著降低（以66.68 mg/kg劑量組最低，P<0.05或P<0.01），1.04～533.44（除4.17外） mg/kg劑量組大鼠血清中SOD水平均顯著升高（P<0.05），16.67～66.68、533.44 mg/kg劑量組大鼠血清中MDA水平均顯著降低（P<0.05），Dmax為66.68 mg/kg、Emax為2.13%、AUClast為5 219.36 mg/kg、MRTlast為340.521 mg/kg；腦缺血72 h，七十味珍珠丸各劑量組腦梗死率、MDA水平均無顯著降低（P>0.05），SOD水平均無顯著升高（除0.52 mg/kg劑量組外，P>0.05）。結論：七十味珍珠丸治療大鼠腦缺血再灌注損傷的最佳有效時間點為48 h、Dmax為66.68 mg/kg，其改善機制可能與增強SOD水平、降低MDA水平有關。

關鍵詞 七十味珍珠丸；腦缺血再灌注損傷；量效關系；時效關系；腦梗死率

Study on the Dose-time-effect Relationship of Tibetan Medicine Rannasangpei in Cerebral Ischemia- reperfusion Injury Model Rats with Intragastric Administration

LIANG Yuan1，F(xiàn)U Ke1，WANG Zhang2，SUN Weijun1，XU Wenlong1，JIA Xiaojing2，XU Peiyan2，CHEN Lu2（1.College of Pharmacy， Chengdu University of TCM， Chengdu 610075， China；2.College of Ethnomedicine， Chengdu University of TCM， Chengdu 610075， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the dose-time-effect relationship of Tibetan medicine Rannasangpei in cerebral ischemic- reperfusion injury model rats with intragastric administration. METHODS： The rats were randomly divided into sham operation group （normal saline， 10 mL/kg）， model control group （normal saline， 10 mL/kg）， positive control group （nimodipine， 30 mg/kg）， Rannasangpei different dose groups （0.52， 1.04， 2.08， 4.17， 8.33， 16.67， 33.34， 66.68， 133.36， 266.72 and 533.44 mg/kg）， with 18 rats in each group. Each group was given relevant medicine intragastrically once； 25 min after intragastric administration， cerebral ischemic-reperfusion injury model was established with suture-occluded method in those groups except for sham operation group. 24， 48， 72 h after cerebral ischemia， neuroethology of rats were graded in each group. The rate of cerebral infraction was detected to evaluate the optimal effective time， the optimal dose （Dmax） and maximal effect （the rate of minimum cerebral infraction， Emax） of Ratnasampil at different periods of cerebral ischemia. Dose-time-effect relationship of Rannasangpei dose with the rate of cerebral infraction was fitted with Thermo Kinetica 5.1 software. The area under curve （AUClast） and retention dose （MRTlast） of dose-effect curve were calculated， and detect the levels of SOD and MDA. RESULTS： Compared with sham operation group， the neurobehavior of model group was significantly abnormal （P<0.05 or P<0.01）， and the rate of cerebral infarction was significantly increased （P<0.01）； the level of SOD was decreased significantly （P<0.01， 48 h）， and the level MDA was increased significantly （P<0.05， 48 h）. Compared with model control group， there was no significant change in neurobehavioral abnormalities in the nimodipine group （P>0.05）， and the rate of cerebral infraction was decreased significantly （P<0.01， 24， 48 h）. The level of SOD in rats were increased significantly （P<0.01， 48 h）， while the level MDA decreased significantly （P<0.05， 48 h）. Rannasangpei 2.08-33.34 mg/kg could significantly improved neurobehavioral abnormalities （P<0.05， 24 h）； 24 h after cerebral ischemia， the rate of cerebral infraction was decreased significantly in Rannasangpei 4.17-133.36 mg/kg group （the lowest is 33.34 mg/kg group， P<0.05 or P<0.01）. The level of SOD in rats were increased significantly in 33.34-533.44 mg/kg groups （P<0.05）. the level MDA was decreased significantly in 0.52-2.08， 8.33， 33.34， 266.72 and 533.44 mg/kg groups （P<0.05）. Dmax was 33.34 mg/kg， Emax was 3.02%， AUClast was 5 141.76 mg/kg and MRTlast was 329.161 mg/kg. 48 h after cerebral ischemia， the rate of cerebral infraction was decreased significantly in Rannasangpei 2.08-133.36 mg/kg groups （the lowest is 66.68 mg/kg group， P<0.05 or P<0.01）， while the level of SOD was increased significantly in 1.04-533.44（except for 4.17）mg/kg groups （P<0.05）. The level of MDA was decreased significantly in 16.67-66.68， 533.44 mg/kg groups （P<0.05）， Dmax was 66.68 mg/kg， Emax was 2.13%， AUClast was 5 219.36 mg/kg and MRTlast was 340.521 mg/kg. 72 h after cerebral ischemia， the rate of cerebral infraction and the level of MDA had no significant decreased in Rannasangpei groups （P>0.05）， and the levels of SOD had no significant increase （except for 0.52 mg/kg group， P>0.05）. CONCLUSIONS： The optimal effective time of Rannasangpei for the treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats is 48 h， and the Dmax is 66.68 mg/kg. The improvement mechanism may be related to increase the level of SOD and decrease the level of MDA.

KEYWORDS Rannasangpei； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Dose-effect relationship； Time-effect relationship； Rate of cerebral infarction

中風嚴重危害人類的生命健康，其中缺血性中風占80%以上，最常見的是腦血栓或腦梗死[1-4]。現(xiàn)代醫(yī)學認為缺血性腦損傷后，腦組織因供血、供氧不足引起神經(jīng)細胞的凋亡和壞死[3]，破壞血腦屏障的完整性[5]，進而導致細胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應，其中丙二醛（MDA）作為脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物，可間接地反映細胞損傷程度[6-7]。當MDA增多時超氧化物歧化酶（SOD）的消耗隨之增加，活性顯著下降[8]。

藏醫(yī)將中風與中風后遺癥統(tǒng)稱為白脈病[9]，是由瘟疫病、毒病、熱病等侵害導致。七十味珍珠丸始載于藏醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》，用于治療黑白脈病、龍血不調(diào)、中風、癱瘓等疾病[5]；其說明書用法用量為重癥患者每日1 g（1丸），一般患者每隔3～7 d服用1 g。由于七十味珍珠丸治療的病種繁多，對于缺血性中風的治療，臨床上既無特定的用量標準，亦不清楚最佳有效時間點（藥物在體內(nèi)治療作用最佳的時間點）和最佳給藥劑量，用法用量隨意性大，容易增加不良反應的發(fā)生率。

本課題組前期對七十味珍珠丸的量效關系和時效關系分別進行了一些探索[5，10]，但是缺乏系統(tǒng)性和關聯(lián)研究。故筆者在前期研究的基礎上，系統(tǒng)研究七十味珍珠丸治療大鼠腦缺血再灌注損傷的量-時-效關系，以期確定其最佳有效時間點和最佳給藥劑量（Dmax），為后期深入研究其作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS-600L電子秤（上海有聲衡器有限公司）；BP121S電子天平（德國賽多利斯儀器有限公司）；V-1100D可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；TDZ5-WS低速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

七十味珍珠丸（西藏甘露藏藥股份有限公司，批號：14049A、16044A，規(guī)格：1 g/丸）；尼莫地平片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJ17436、BJ30601，規(guī)格：30 mg/片）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，上海靈錦精細化工有限公司，批號：20160500）；硫酸慶大霉素注射液（四川省長征藥業(yè)股份有限公司，批號：20170704，規(guī)格：4 IU/mL）；SOD、MDA試劑盒均購至南京建成生物工程研究所。

1.3 動物

SPF級SD大鼠336只，♂，體質(zhì)量（260±10） g，購自四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-19。購入后自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～26 ℃。

2 方法

2.1 分組與給藥

大鼠隨機分為假手術組（生理鹽水，10 mL/kg），模型組（生理鹽水，10 mL/kg），陽性對照組（尼莫地平片，30 mg/kg，為成人臨床日用劑量的5倍換算而得），七十味珍珠丸0.52 、1.04、2.08、4.17、8.33、16.67、33.34、66.68、133.36、266.72、533.44 mg/kg劑量組（按照重癥患者日用劑量的0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32倍換算而得）。各組大鼠均于手術前25 min灌胃給藥1次。

2.2 造模

灌胃給藥25 min后，參考文獻方法[11]沿大鼠頸部正中線偏右作一切口分離右側頸總動脈、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA）和翼腭動脈，在分叉處結扎ECA和翼腭動脈，于ECA遠心端的結扎線和近心端的松結之間剪一小口，在自制挑針的輔助下將拴線插入到ICA，插入長度約20 mm，動脈阻斷2 h后進行再灌注，然后縫合手術創(chuàng)口并消毒。假手術組僅在大鼠動脈處備線處理，不造模。術中保溫（37±0.5） ℃至大鼠清醒。

2.3 神經(jīng)行為學評級

參考文獻方法[12-13]在大鼠腦缺血24、48、72 h時對其神經(jīng)行為學進行評級：-級，無神經(jīng)損傷癥狀；Ⅰ級，不能完全伸展左側前爪；Ⅱ級，向左側轉圈；Ⅲ級，向左側傾倒；Ⅳ級，不能自發(fā)行走，意識喪失。

2.4 腦梗死率測定和量-時-效關系擬合

大鼠腦缺血24、48、72 h時，各組隨機選取6只大鼠麻醉，立即斷頭取全腦組織，濾紙吸干腦組織表面水分，稱質(zhì)量后將其置于-20 ℃冰箱中速凍20～30 min，用配好的1% TTC溶液染色30 min，分離梗死組織呈蒼白色部分并稱質(zhì)量，然后計算腦梗死率（腦梗死率=腦梗死組織質(zhì)量/腦組織質(zhì)量×100%）。根據(jù)腦梗死率考察腦缺血24、48、72 h時有效劑量范圍、最佳給藥劑量（Dmax）、有效時間范圍、最佳有效時間、最大效應（最小腦梗死率，Emax）。然后采用Thermo Kinetica 5.1軟件對腦缺血24、48、72 h時七十味珍珠丸各給藥劑量與腦梗死率進行量效關系擬合，并計算相關參數(shù)，量效曲線下面積（AUClast）和滯留劑量（MRTlast）。

2.5 血清中SOD、MDA水平測定

大鼠缺血再灌注24、48、72 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈采血5 mL，離心（3 500 r/min，10 min）分離血清，取上清液，測定血清中SOD、MDA的水平，具體操作嚴格按相關試劑盒方法進行。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；等級資料采用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 神經(jīng)行為學評級

與假手術組比較，模型對照組大鼠在24、48、72 h時均有明顯的神經(jīng)行為顯著異常（P<0.05或P<0.01），表現(xiàn)為大鼠向左轉圈，向左側傾倒，左前腳不自然伸直等；與模型對照組比較，尼莫地平組大鼠的神經(jīng)行為異常無顯著變化（P>0.05）；七十味珍珠丸2.08～33.34 mg/kg劑量組大鼠的神經(jīng)行為異常顯著改善（P<0.05，24 h），七十味珍珠丸0.52 mg/kg劑量組大鼠的神經(jīng)行為異常顯著改善（P<0.05，48、72 h）。各組大鼠神經(jīng)行為學評級見表1。

3.2 腦梗死率和量時效關系結果

3.2.1 腦梗死率 與假手術組比較，模型對照組大鼠腦梗死率顯著增加（P<0.01）；與模型對照組比較，尼莫地平片組大鼠腦梗死率顯著降低（P<0.01，24、48 h），腦缺血24 h時，七十味珍珠丸4.17～133.36 mg/kg劑量組大鼠腦梗死率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），有效劑量范圍為4.17～133.36 mg/kg、Dmax為33.34 mg/kg、Emax為3.02%；腦缺血48 h時，七十味珍珠丸2.08～133.36 mg/kg劑量組大鼠腦梗死率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），有效劑量范圍為2.08～133.36 mg/kg、Dmax為66.68 mg/kg、Emax為2.13%；腦缺血72 h時，七十味珍珠丸各劑量組腦梗死率均無顯著降低（P>0.05）。由此可知有效時間范圍為2～48 h，最佳有效時間點為腦缺血后48 h。各組大鼠腦梗率結果詳見表2。

3.1.2 量-時-效關系擬合 大鼠腦缺血24、48、72 h時，采用Thermo Kinetica 5.1軟件對七十味珍珠丸各劑量與腦梗死率進行量-時-效關系的擬合，結果見圖1。

大鼠腦缺血24 h時，七十味珍珠丸AUClast為 5 141.76 mg/kg，MRTlast為329.161 mg/kg；大鼠腦缺血48 h時，七十味珍珠丸AUClast為5 219.36 mg/kg，MRTlast為340.521 mg/kg；大鼠腦缺血72 h時，七十味珍珠丸AUClast為5 680.20 mg/kg，MRTlast為304.295 mg/kg。

3.3 血清中SOD、MDA水平測定結果

3.3.1 SOD水平測定結果 與假手術組比較，模型對照組大鼠血清中SOD水平顯著降低（P<0.01，48 h）；與模型對照組比較，尼莫地平片組大鼠血清中SOD水平顯著升高（P<0.01，48 h）；腦缺血24 h，七十味珍珠丸33.34～533.44 mg/kg劑量組大鼠血清中SOD水平均顯著升高（P<0.05）；腦缺血48 h，1.04～533.44（除4.17外）mg/kg劑量組大鼠血清中SOD水平均顯著升高（P<0.05）；腦缺血72 h，七十味珍珠丸各劑量組大鼠血清中SOD水平無顯著升高（除0.52 mg/kg劑量組外，P>0.05）。各組大鼠血清中SOD水平測定結果見表3。

3.3.2 MDA水平測定結果 與假手術組比較，模型對照組大鼠血清中MDA水平顯著升高（P<0.05，48 h）；與模型對照組比較，尼莫地平片組大鼠血清中MDA水平顯著降低（P<0.05，48 h）；腦缺血24 h，0.52～2.08、8.33、33.34、266.72、533.44 mg/kg劑量組大鼠血清中MDA水平均顯著降低（P<0.05）；腦缺血48 h，16.67～66.68、533.44 mg/kg劑量組大鼠血清中MDA水平均顯著降低（P<0.05）；腦缺血72 h，七十味珍珠丸各劑量組大鼠血清中MDA水平均無顯著降低（P>0.05）。各組大鼠血清中MDA水平測定結果見表4。

4 討論

本課題組在前期[5]中探討大鼠腦缺血2、24 h時，七十味珍珠丸0.52、1.04、2.08、4.17、8.33、16.67、33.34、66.68、133.36 mg/kg 9個劑量組治療大鼠腦缺血再灌注損傷的量效關系，但設置的時間點較少，不利于確定最佳有效時間點；在此基礎上，本課題組又探討了大鼠腦缺血2、6、12、24、48、72 h時，劑量為33.50 mg/kg的七十味珍珠丸與大鼠腦缺血再灌注的時效關系[10]，由于僅設置1個劑量組，不利于明確最佳用藥劑量及有效劑量范圍。因此本研究在前期實驗的基礎上，系統(tǒng)研究七十味珍珠丸治療大鼠腦缺血再灌注損傷的量-時-效關系。

本次研究結果發(fā)現(xiàn)，七十味珍珠丸可不同程度地改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)行為學異常；由大鼠腦缺血24、48、72 h時的腦梗死率可知七十味珍珠丸治療腦缺血再灌注損傷模型大鼠的有效劑量范圍為2.08～133.36 mg/kg，最佳給藥劑量為66.68 mg/kg，將七十味珍珠丸的腦梗死率有統(tǒng)計學意義的時間點作為有效時間，其有效時間范圍為2～48 h，最佳有效時間點為48 h，由此也說明七十味珍珠丸給藥后具有緩釋樣效應。大鼠灌胃七十味珍珠丸的臨床等效劑量為83.33 mg/kg（成人日用劑量的5倍），其在有效劑量范圍內(nèi)，證明了其臨床用量的合理性；而有效時間范圍2～48 h與臨床給藥時間不一致，臨床上推薦每隔3～7 d給藥1次，而本研究結果表明最佳有效時間點為48 h，即每隔2 d給藥1次，由此建議臨床上可每隔2 d服藥1次。

腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚未闡明，但氧自由基學說引起了人們的重視[14]。在發(fā)生腦缺血再灌注時，神經(jīng)細胞重新獲得供氧，在腦組織缺血、缺氧得到緩解的同時會產(chǎn)生大量的自由基，加重腦組織損傷[15-16]。本研究結果顯示，腦缺血24、48、72 h時，七十味珍珠丸可增加大鼠血清中SOD的活性；腦缺血24、48 h時，七十味珍珠丸可降低大鼠血清中MDA的活性，由此表明七十味珍珠丸對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織具有保護作用。

綜上所述，七十味珍珠丸能改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)行為學異常，降低大鼠的腦梗死率，其改善機制可能與增強SOD活性、降低MDA水平有關。七十味珍珠丸治療大鼠腦缺血再灌注損傷的有效劑量范圍為2.08～133.36 mg/kg，最佳給藥劑量為66.68 mg/kg；有效時間范圍為2～48 h，最佳有效時間點為48 h，本實驗結果也可為后期深入研究七十味珍珠丸對血腦屏障的相關作用提供參考。

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（收稿日期：2018-08-07 修回日期：2018-11-01）

（編輯：唐曉蓮）