基于血漿代謝組學(xué)的附子脂溶性生物堿對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的毒性作用機(jī)制研究

謝運(yùn)飛 李蕓霞 劉美辰 周憶夢(mèng) 王彪 彭成

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）01-0078-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.17

摘 要 目的：研究附子脂溶性生物堿對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（AIA）模型大鼠的毒性作用機(jī)制。方法：將40只大鼠隨機(jī)分為空白組（超純水）、模型組（超純水）和附子脂溶性生物堿低、高劑量組（12.5、35 mg/kg），每組10只。除空白組外，其余各組大鼠均于右后足墊部位注射0.1 mL完全弗氏佐劑復(fù)制AIA模型。造模19 d后開始灌胃給藥，每天1次。連續(xù)給藥14 d后，采用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)分離并鑒定血漿中內(nèi)源性代謝物，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA），通過變量投影重要度值（VIP）>1和P值（<0.05）篩選血漿中的差異代謝物；并根據(jù)差異代謝物查閱京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫，推測(cè)附子脂溶性生物堿對(duì)AIA大鼠的毒性作用機(jī)制。結(jié)果：共鑒定出57個(gè)血漿代謝物，并確定了L-脯氨酸、6-羥基煙酸、腺苷等11個(gè)差異代謝物。AIA造模后可引起大鼠血漿中L-脯氨酸和尿苷酸含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），脫氧胞苷含量顯著升高（P<0.01）。低劑量附子脂溶性生物堿給藥后可使模型大鼠血漿中腺苷和L-脯氨酸含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），血漿中脫氧膽酸含量顯著升高（P<0.05）；而高劑量附子脂溶性生物堿給藥后可使模型大鼠血漿中6-羥基煙酸、腺苷、肉堿、L-脯氨酸、N-甲酰氨基苯甲酸含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），血漿中脫氧膽酸、L-精氨酸、脫氧胞苷、L-賴氨酸含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：低劑量附子脂溶性生物堿對(duì)AIA模型大鼠的毒性較??；高劑量附子脂溶性生物堿對(duì)AIA模型大鼠的毒性作用可能與其引起膽汁分泌異常及賴氨酸生物合成及嘌呤、嘧啶、色氨酸、脯氨酸、精氨酸代謝紊亂有關(guān)。

關(guān)鍵詞 附子；脂溶性生物堿；代謝組學(xué)；佐劑性關(guān)節(jié)炎；毒性機(jī)制；大鼠

Study on Toxicity Mechanism of Aconitum carmichaeli Lipid-soluble Alkaloids to Adjuvant-induced Arthritis Model Rats Based on Plasma Metabolomics

XIE Yunfei1，2，LI Yunxia1，LIU Meichen1，ZHOU Yimeng1，WANG Biao1，PENG Cheng1（1.School of Pharmacy， Chengdu University of TCM/Key Lab Breeding Base of Systematic Research & Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology， Chengdu 611137， China；2.Dept. of Nuclear Medicine Sichuan Academy of Medical Sciences/Sichuan Provincial People’s Hospital， Chengdu 610072， China）

ABSTRACT OBJECTIVE：To study the toxicity mechanism of lipid-soluble alkaloids of Aconitum carmichaeli to adjuvant-induced arthritis （AIA） model rats. METHODS： Totally 40 rats were randomly divided into blank group （ultrapure water）， model group （ultrapure water） and A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids low-dose and high-dose groups （12.5， 35 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except for blank group， rats in other groups were given complete Freund’s adjuvant 0.1 mL on the right hind paw to induce AIA model. 19 d after modeling， they were given relevant medicine intragastrically， once a day. After 14 d of administration， endogenous metabolites were separated and identified from plasma by UPLC-LTQ/Orbitrap MS. Then， the collected data were analyzed by principal component analysis （PCA） and partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA）. Variable importance projection （VIP）>1 and P value （<0.05） were used to screen differential metabolites in plasma. Retrieving the database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes according to the differential metabolites，the toxic mechanism of A. carmichaeli liposoluble alkaloids to AIA rats were speculated. RESULTS： A total of 57 plasma metabolites were indentified， and 11 differential metabolites such as L-proline， 6-hydroxynicotinic acid and adenosine were identified. After inducing AIA model， the plasma contents of L-proline and uridylic acid were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and the content of deoxycytidine was increased significantly （P<0.01）. Low dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids could decrease the plasma contents of adenosine and L-proline in rats （P<0.05 or P<0.01）， while the plasma contents of deoxycholic acid was increased significantly （P<0.05）. High dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids could decrease the plasma contents of 6-hydroxynicotinic acid， adenosine， carnitine， L-proline， N-formylaminobenzoic acid were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the plasma contents of deoxycholic acid， L-arginine， deoxycytidine and L-lysine were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The toxicity of low-dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids to AIA model rats is less； the toxicity of high-dose of A. carmichaeli lipid-soluble alkaloids to AIA model rats may be related to abnormal bile secretion， lysine biosynthesis and metabolic disorders of purine， pyrimidine， tryptophan， proline and arginine.

KEYWORDS Aconitum carmichaeli； Lipid-soluble alkaloids； Metabolomics； Adjuvant-induced arthritis model； Toxic mechanism； Rat

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli Debx.）的子根加工品，味辛、甘，大熱，有毒，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛等功效[1]。附子因含有毒性生物堿而被列入有毒中藥。附子的脂溶性生物堿是其重要生物活性成分，主要由單酯二萜類烏頭堿（MDAs）和雙酯二萜類烏頭堿（DDAs）組成[2]。附子的鎮(zhèn)痛、抗炎和強(qiáng)心作用與脂溶性生物堿存在密切相關(guān)[3]。但其安全劑量狹窄，過量服用可引起胃腸道、神經(jīng)和心臟毒性[4]，嚴(yán)重中毒者甚至在幾分鐘內(nèi)就會(huì)死亡[5]。盡管已有通過代謝組學(xué)技術(shù)揭示烏頭類植物毒性的報(bào)道，如川烏、附子炮制品（黑順片）及烏頭類生物堿毒性機(jī)制的代謝組學(xué)研究[6-9]。但多數(shù)研究?jī)H在正常動(dòng)物體中進(jìn)行，缺乏對(duì)特定疾病動(dòng)物模型的研究。本研究基于超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱結(jié)合高分辨質(zhì)譜（UPLC-LTQ/Orbitrap MS）技術(shù)和模式識(shí)別方法，通過血漿代謝組學(xué)，研究不同劑量附子脂溶性生物堿引起的內(nèi)源性代謝物的變化，以探討其對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（AIA）模型大鼠的毒性機(jī)制，為附子用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎所致的不良反應(yīng)及毒性損害提供參考依據(jù)，保障其用藥安全。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY型UPLC儀（美國(guó)Waters公司）；LTQ Orbitrap XL型質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；KDC-2046型低速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；AL204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

附子黑順片炮制品（四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：160901，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室裴瑾教授鑒定為毛茛科植物烏頭子根的黑順片炮制品）；甲醇（上海沃凱化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180201，色譜純）；乙腈（德國(guó)Merck公司，批號(hào)：SHBJ8804，色譜純）；甲酸（日本TCI公司，批號(hào)：N2S2C-0G，色譜純）；完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBV6895）；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水（Milli-Q級(jí)別）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只，♀，體質(zhì)量180～220 g，購自四川省中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2013-19。給予標(biāo)準(zhǔn)飲食和清潔用水，在平均溫度為（20±2） ℃、相對(duì)濕度為（55±5）%條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 附子脂溶性生物堿的制備

取附子黑順片炮制品5 kg并粉碎，用二氯甲烷浸潤(rùn)后轉(zhuǎn)入5% Na2CO3溶液中浸潤(rùn)30 min。然后將藥材轉(zhuǎn)入水浴鍋中，用二氯甲烷加熱回流提取2次，第1次8倍量體積提取2 h，第2次6倍量體積提取1 h，水浴溫度均為65 ℃。合并2次提取液，回收溶劑并濃縮至體積為2.5 L。將藥液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用0.05 mol/L H2SO4等體積萃取2次，合并萃取所得酸水液，加氨水調(diào)溶液pH至9～10，再用二氯甲烷等體積萃取3次，合并萃取液并回收二氯甲烷，得附子脂溶性生物堿約12.5 g。臨用前用純水配制成相應(yīng)的濃度。

2.2 分組、造模與給藥

將40只大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白組、模型組和附子脂溶性生物堿低、高劑量組，每組10只。模型組和附子脂溶性生物堿低、高劑量組大鼠在右后足墊部位注射0.1 mL完全弗氏佐劑復(fù)制AIA模型[10]，空白組大鼠在相同部位注射0.1 mL生理鹽水。大鼠造模19 d后開始給藥，灌胃體積均為2 mL/100 g。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，AIA模型大鼠對(duì)附子脂溶性生物堿的最大耐受劑量為35 mg/kg，故將此作為高劑量組的給藥劑量，而低劑量組則選擇最大耐受量的約1/3作為給藥劑量，即12.5 mg/kg，空白組和模型組大鼠給予相應(yīng)體積超純水作為對(duì)照。每天1次，持續(xù)給藥14 d。

2.3 血漿樣本收集及處理

末次給藥后2 h，所有大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管從腹主動(dòng)脈采集血液樣品，并迅速轉(zhuǎn)入低溫離心機(jī)中，設(shè)置1 600×g離心力和4 ℃離心溫度，離心15 min。然后將上清液的血漿樣本轉(zhuǎn)移至無菌凍存管中，液氮速凍并在-80 ℃低溫冰箱中保存。

2.4 LC-MS分析系統(tǒng)條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為40 ℃；溶劑A為含0.1%甲酸的水，溶劑B為含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫（0～1 min，2%B；1～9.5 min，2%→50%B；9.5～14 min，50%→98%B；14～15 min，98%B；15～15.5 min，98%→2%B；15.5～17 min，2%B）；流速為0.25 mL/min；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀采用正（+）、負(fù)（-）離子電離模式，正離子噴霧電壓為4.8 kV，負(fù)離子噴霧電壓為4.5 kV，鞘氣流速為45 arb，輔助氣流速15 arb；毛細(xì)管溫度為325 ℃；正、負(fù)離子模式下的毛細(xì)管電壓為35 V/-15 V，管透鏡電壓為50 V/-50 V；以分辨率60 000進(jìn)行全掃描，掃描范圍89～1 000，采用誘導(dǎo)碰撞解離（CID）進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除（重復(fù)計(jì)數(shù)為2）去除無必要的MS/MS信息，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為15 s。

2.5 血漿代謝物的輪廓分析及鑒別

將血漿樣本在4 ℃下融化，然后取200 μL于含有800 μL甲醇的1.5 mL離心管中，振蕩60 s，混勻，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一1.5 mL離心管中，真空濃縮干燥后，用300 μL的80%甲醇復(fù)溶，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得待測(cè)樣品。將待測(cè)樣品按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，可見各組的代謝圖譜均存在一定程度的差異。根據(jù)質(zhì)譜中化合物的精確分子量和碎片離子信息，與常用的代謝物數(shù)據(jù)庫HMDB、Metlin、Massbank等在線比對(duì)后共檢測(cè)出了4 769個(gè)前體分子，并鑒定出了57個(gè)血漿代謝物?？傠x子流圖（TIC圖）見圖1。

2.6 主成分分析（PCA）

作為非監(jiān)督的多元分析方法，PCA可直觀了解圖中每個(gè)樣本的空間分布，掌握各組大鼠體內(nèi)代謝物的整體變化趨勢(shì)。應(yīng)用SIMCA-P 13.0軟件（瑞典Umetrics公司）對(duì)正、負(fù)離子模式下4個(gè)血漿樣品的所有變量進(jìn)行PCA分析，進(jìn)一步確定代謝物的差異性。結(jié)果，4個(gè)血漿樣品中代謝物呈現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)，構(gòu)建的PCA模型參數(shù)為正離子模式：R2X=0.41、負(fù)離子模式：R2X=0.49（R2X：對(duì)X軸的解釋度）。PCA評(píng)分圖見圖2。

2.7 差異代謝物的確定及毒性相關(guān)通路分析

作為有監(jiān)督的多元分析方法，偏最小二乘判別分析（PLS-DA）能進(jìn)一步區(qū)分分析組的差異，并通過變量投影重要度值（VIP）確認(rèn)潛在的生物標(biāo)志物。應(yīng)用SIMCA-P 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析，建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型。該模型投影中VIP>1的變量，被認(rèn)為是潛在代謝生物標(biāo)志物；再進(jìn)一步應(yīng)用SPSS 21.0軟件（美國(guó)IBM公司）對(duì)篩選出的潛在代謝生物標(biāo)志物進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P<0.05為條件得出差異代謝物。

結(jié)果，各組間的代謝物可見很大程度的分離。構(gòu)建的PLS-DA模型參數(shù)為正離子模式：R2X=0.364，R2Y=0.956，Q2=0.828；負(fù)離子模式：R2X=0.552，R2Y=0.986，Q2=0.791（R2Y：對(duì)Y軸的解釋度，Q2：模型的預(yù)測(cè)度）。從已鑒定的57個(gè)化合物中篩選出了25個(gè)與附子脂溶性生物堿毒性相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，并確定了其中6-羥基煙酸、腺苷、脫氧膽酸等11個(gè)差異代謝物。與空白組比較，模型組大鼠血漿中6-羥基煙酸、脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、L-精氨酸、脫氧胞苷和L-賴氨酸含量升高，尿苷酸、N-甲酰氨基苯甲酸、L-脯氨酸、肉堿和腺苷含量降低，其中L-脯氨酸、脫氧胞苷、尿苷酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，附子脂溶性生物堿低劑量組大鼠血漿中除脫氧膽酸含量升高外，其余10個(gè)化合物含量均降低，其中腺苷、脫氧膽酸和L-脯氨酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；附子脂溶性生物堿高劑量組大鼠血漿中5個(gè)化合物（脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、L-精氨酸、脫氧胞苷和L-賴氨酸）含量升高，其余6個(gè)化合物含量降低，且除甘氨鵝脫氧膽酸和尿苷酸外的其余9個(gè)化合物含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。差異代謝物通過查閱京都基因與基因組百科全書（KEGG）等在線數(shù)據(jù)庫，確認(rèn)其主要涉及脂肪、膽汁酸、氨基酸、能量和嘧啶代謝。PLS-DA評(píng)分圖見圖3，潛在生物標(biāo)志物鑒定結(jié)果見表1，毒性機(jī)制關(guān)聯(lián)圖見圖4。

3 討論

代謝組學(xué)可對(duì)機(jī)體內(nèi)源性代謝物及其變化進(jìn)行快速識(shí)別和定量分析，探索代謝物變化與生理病理變化的直接關(guān)系[11]。本研究基于UPLC-LTQ/Orbitrap MS的代謝組分析技術(shù)，研究了不同劑量的附子脂溶性生物堿給藥后AIA模型大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物的變化，以揭示附子脂溶性生物堿在AIA模型大鼠用藥過程中所產(chǎn)生的相關(guān)毒性作用機(jī)制。并且通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計(jì)分析，共篩選出了11種與附子脂溶性生物堿毒性相關(guān)的差異代謝物，并分析了可能的毒性作用機(jī)制。

3.1 膽汁酸代謝異常

在長(zhǎng)鏈脂肪酸的線粒體穿梭中，肉堿作為重要的中間體，全程參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。在本研究中，附子脂溶性生物堿高劑量組大鼠血漿中肉堿含量較空白組和模型組均明顯降低，這提示附子脂溶性生物堿的毒性劑量（高劑量）破壞了肉堿的平衡，可能導(dǎo)致脂肪酸代謝的紊亂。脫氧膽酸是一種游離膽汁酸，在肝損傷情況下，由于肝內(nèi)膽汁酸的合成、清除及腸吸收受到干擾，可導(dǎo)致血漿中膽汁酸水平升高[13]。甘氨鵝脫氧膽酸參與初級(jí)膽汁酸生物合成，是毒性最大的膽汁酸之一，其可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和膽道上皮細(xì)胞損傷[14-15]。本研究結(jié)果顯示，附子脂溶性生物堿低、高劑量組大鼠血漿中脫氧膽酸水平較模型組顯著升高，高劑量組升高程度較低劑量組更為明顯，且高劑量組大鼠血漿中甘氨鵝脫氧膽酸的水平也有一定程度的上調(diào)。該結(jié)果表明，附子脂溶性生物堿可引起肝損傷和膽汁酸代謝紊亂，且損傷程度與用藥劑量呈正相關(guān)。

3.2 氨基酸代謝異常

N-甲酰氨基苯甲酸是色氨酸通過尿氨酸途徑的代謝產(chǎn)物，其可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為喹啉酸進(jìn)入色氨酸-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸途徑或轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，參與三羧酸循環(huán)[16]。喹啉酸可進(jìn)一步代謝為煙酸，并降解為6-羥基煙酸[17]。本研究結(jié)果顯示，附子脂溶性生物堿高劑量組大鼠血漿中N-甲酰氨基苯甲酸和6-羥基煙酸水平明顯降低，這表明附子脂溶性生物堿的毒性劑量可能導(dǎo)致色氨酸代謝途徑的紊亂。

在肝中，精氨酸在鳥氨酸循環(huán)中被水解，形成的鳥氨酸隨后可轉(zhuǎn)化為脯氨酸和多胺，其代謝產(chǎn)生的尿素由腎臟排出體外[18]。研究表明，賴氨酸和精氨酸在腸黏膜由同一載體運(yùn)輸，且在腎小管也被相同的載體轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。賴氨酸與精氨酸由于存在競(jìng)爭(zhēng)性的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，所以過量的賴氨酸可能間接影響精氨酸的代謝[20]。本研究結(jié)果顯示，附子脂溶性生物堿高劑量組大鼠血漿中L-精氨酸和L-賴氨酸水平較模型組顯著升高，這表明附子脂溶性生物堿的毒性劑量可引起肝臟中部分氨基酸的代謝紊亂，而賴氨酸與精氨酸的代謝紊亂也相互作用。模型組以及附子脂溶性生物堿低、高劑量組大鼠血漿中L-脯氨酸水平較空白組均顯著降低，且給藥組的降低程度更為顯著，這表明AIA模型大鼠由于自身疾病原因而造成脯氨酸代謝紊亂，而附子脂溶性生物堿給藥后能加重脯氨酸的代謝紊亂程度。

3.3 能量代謝異常

腺苷是合成腺苷酸、腺嘌呤和三磷酸腺苷的必需中間體[21]。本研究結(jié)果顯示，給藥組大鼠血漿中腺苷水平較模型組顯著降低，這表明附子脂溶性生物堿可能干擾了腺苷代謝而直接影響到機(jī)體的能量代謝。

3.4 嘧啶代謝異常

尿苷酸是脫氧胞苷的中間體，而脫氧胞苷是DNA鏈形成的必需成分。DNA的氧化損傷可能導(dǎo)致體內(nèi)脫氧胞苷水平的異常[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組和附子脂溶性生物堿高劑量組大鼠血漿中尿苷酸水平較空白組顯著降低，而脫氧胞苷水平較空白組顯著升高，均表明AIA模型大鼠由于自身疾病原因可能導(dǎo)致了DNA的損傷，而附子脂溶性生物堿的毒性劑量不僅無法緩解，還會(huì)加重其DNA損傷，導(dǎo)致嘧啶代謝紊亂。

綜上所述，對(duì)11種差異代謝物的分析表明，附子脂溶性生物堿的毒性劑量可引起膽汁分泌異常、賴氨酸生物合成和嘌呤、嘧啶、色氨酸、脯氨酸、精氨酸代謝的紊亂，大多數(shù)內(nèi)源性代謝物的改變與藥物誘導(dǎo)的肝損傷密切相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為揭示附子治療AIA過程中所產(chǎn)生的毒性機(jī)制提供了參考依據(jù)，但后續(xù)研究需配合相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善并加以佐證。

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（收稿日期：2018-08-23 修回日期：2018-11-11）

（編輯：林 靜）