葒草花提取物對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用研究

劉俊宏 王昌權 夏濤 向文英 鄭林 李勇軍 李月婷

貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴陽 550004）

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0068-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.15

摘 要 目的：研究葒草花提取物對心肌缺血再灌注損傷（MIRI）模型大鼠的保護作用，為其藥用資源的深度開發(fā)提參考。方法：將24只大鼠隨機分為假手術組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、復方丹參片組（陽性對照，0.17 g/kg）和葒草花提取物組（以生藥計為86 g/kg），每組6只。每天灌胃給藥 1次，劑量均為2 mL/100 g。連續(xù)給藥4 d后，除假手組外，其余各組大鼠均采用左冠狀動脈前降支法復制MIRI模型。再灌注24 h后再給藥1次，給藥結束后監(jiān)測各組大鼠心電圖ST段變化，檢測各組大鼠血漿中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌酸激酶（CK）、心肌鈣蛋白（cTn-I）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）水平，計算各組大鼠心肌梗死率并觀察其心肌組織病理形態(tài)學變化。結果：與假手術組比較，模型組大鼠心電圖ST段顯著抬高（P<0.01）；血漿中LDH、CK、CK-MB、cTn-I水平顯著升高（P<0.01），SOD、NO水平顯著降低（P<0.01）；心肌梗死率顯著升高（P<0.01），心肌組織發(fā)生炎性細胞浸潤、心肌細胞胞質結構疏松等病理形態(tài)學改變。與模型組比較，復方丹參片組和葒草花提取物組大鼠心電圖ST段顯著下移（P<0.05）；血漿中LDH、CK、CK-MB、cTn-I水平顯著降低（P<0.05），SOD、NO水平顯著升高（P<0.05）；心肌梗死率顯著降低（P<0.05），心肌組織中炎性細胞浸潤、組織水腫等病變不同程度減輕。結論：葒草花提取物可能通過抗氧化損傷發(fā)揮其對MIRI的保護作用。

關鍵詞 葒草花提取物；心肌缺血再灌注損傷；氧化損傷；大鼠

Study on Protective Effects of Polygonum orientale Extract on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury Model Rats

LIU Junhong1，WANG Changquan2，3，XIA Tao2，3，XIANG Wenying2，3，ZHENG Lin2，LI Yongjun4，LI Yueting2 （1.Guizhou Province Center for Food and Drug Evaluation and Inspection， Guiyang 550004， China；2.Guizhou Provincial Key Lab of Pharmaceutics/State Key Lab of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；3.School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；4.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM （Ministry of Education）， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects of Polygonum orientale extract on myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） model rats， and to provide reference for it’s deeply development of medicinal source. METHODS： Totally 24 rats were randomly divided into sham operation group （normal saline）， model group （normal saline）， Compound danshen tablet group （positive group， 0.17 g/kg） and P. orientale extract group （86 g/kg， calculated by crude drug）， with 6 rats in each group. All groups were given drugs 2 mL/100 g intragastrically once a day. After 4 d of consecutive administration， MIRI model was induced by the left anterior descending branch of arteria coronaria in all groups except for sham operation group. 24 h after reperfusion， they were given related medicine again. After medication， the changes of electrocardiogram ST segment were monitored in each group. The plasma levels of LDH， CK-MB， CK， cTn-I， SOD and NO were detected in each group. The myocardial infarction rate in each group was calculated and the pathomorphological changes in the myocardium were observed. RESULTS： Compared with sham operation group， ST segment of myocardial electrocardiogram was increased in model group （P<0.01）. The plasma levels of LDH， CK， CK-MB and cTn-I were increased significantly （P<0.01）， while the plasma levels of SOD and NO were decreased significantly （P<0.01）. The rate of myocardial infarction was increased significantly （P<0.01）， and pathomorphological changes were observed in myocardial tissue such as infiltration of inflammatory cells and loose cytoplasm of cardiac myocytes. Compared with model group， ST segment of myocardial electrocardiogram was decreased significantly in Compound danshen tablet group and P. orientale extract group （P<0.05）； the plasma levels of LDH， CK， CK-MB and cTn-I were decreased significantly （P<0.05）， while the plasma levels of SOD and NO were increased significantly （P<0.05）； the rate of myocardial infarction was decreased significantly （P<0.05）， and inflammatory cell infiltration and tissue edema in myocardium were relieved to varying degrees. CONCLUSIONS： The protective effect of P. orientale extract protect on MIRI may be exerted by anti-oxidative damage.

KEYWORDS Polygonum orientale extract； Myocardial ischemia and reperfusion injury； Oxidative damage； Rats

葒草花為蓼科植物葒草（Polygonum orientale L.）的花穗，又名水葒花、狗尾巴花、何草花等，以全草入藥，收載于《貴州省中藥、民族藥質量標準》2003年版[1-2]，且在《本草綱目》《中藥大辭典》《中華本草》等中藥典籍中均有記錄[3]，是貴州民間及少數(shù)民族常用藥材，多用于胸痛、胸悶、氣短、中風偏癱（嘴角傾斜）、風濕疼痛等疾病的治療[4-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葒草花經(jīng)水提醇沉后的正丁醇萃取部位可明顯抑制急性心肌缺血模型犬心電圖ST段和T波抬高，降低冠狀動脈結扎所致犬心肌缺血的程度和損傷范圍，抑制冠狀動脈結扎犬血清中肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）的釋放等作用[7]。本研究擬采用心肌缺血再灌注損傷（MIRI）大鼠模型[8]，以心電圖、病理組織形態(tài)學、氧化應激相關生化指標以及心肌酶譜等的變化為評價指標，進一步研究葒草花對MIRI的保護作用，為其藥用資源的深度開發(fā)及利用奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

680型酶標儀[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司]；TGL-16G型離心機（上海安亭儀器廠）；DK-98-ⅡA型恒溫水裕鍋（天津泰斯特儀器廠）；Nikon TS-100F CCD型照相系統(tǒng)和相差顯微觀察系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

葒草花藥材產(chǎn)于貴州省清鎮(zhèn)市（批號：20130608），經(jīng)貴州醫(yī)科大學生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為蓼科植物葒草的花穗；復方丹參片（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號：G17A007，規(guī)格：0.32 g/片）；LDH、CK、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌鈣蛋白（cTn-I）、超化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號：分別為20170405、20170423、20170410、20170508、20170520、20170506）；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠24只，♂，體質量（290±20） g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012-0008，實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2012-0001。

2 方法

2.1 葒草花提取物的制備

取葒草花藥材7 kg，分別用10倍量水煮3次，每次1 h，過濾，合并3次濾液，將濾液濃縮至每1 mL含生藥量為1 g，然后在攪拌下緩慢加入95%乙醇，使溶液含醇量達65%，繼續(xù)攪拌30 min，靜置12 h，抽濾，濾液濃縮至每1 mL含生藥量為 1 g。然后以0.5倍量水飽和正丁醇溶液萃取4次，合并4次正丁醇相，減壓回收正丁醇，干燥得正丁醇提取物。將正丁醇提取物加80%乙醇溶解，上聚酰胺柱，用8倍柱體積的80%乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，減壓回收乙醇，殘留物經(jīng)微波真空干燥，得葒草花有效組分提取物（收膏率為3.43%，提取物中含原兒茶酸8.3 mg/g、槲皮苷22.9 mg/g、山柰素-葡萄糖苷10.7 mg/g、山柰素-鼠李糖苷17.7 mg/g、花旗松素14.9 mg/g和N-p-香豆酰酪胺8.2 mg/g）。

2.2 分組與給藥

將24只大鼠隨機分為假手術組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、復方丹參片組（陽性對照，0.17 g/kg，臨床給藥劑量的等效劑量，以生理鹽水為溶劑） 和葒草花提取物組（以生藥量計為86 g/kg，以生理鹽水為溶劑），每組6只。各組大鼠均于造模前灌胃相應藥物，每天1次，連續(xù)給藥4 d，給藥劑量均為2 mL/100 g。并于末次給藥后按“2.3”方法進行手術，再灌注24 h后，再次按相同劑量給藥1次。

2.3 大鼠MIRI模型的建立

將大鼠禁食不禁水12 h，然后按0.4 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定于手術臺上，連接生物機能實驗系統(tǒng)，二導聯(lián)下實時測心電圖。左胸部備毛，75%乙醇消毒，于胸骨左緣心臟搏動處縱行切開皮膚約2 cm，用止血鉗逐層分離皮下組織、肌肉，再用拉鉤拉開剝離開的肌肉，暴露手術視野。在心臟搏動明顯的3～4肋間打開胸腔，左手從右前區(qū)沿心臟跳動方向擠壓，同時右手用止血鉗深入胸腔引導，使心臟彈出胸腔，左手拇指、食指和中指輕捏住心臟，在左心耳下方以心臟表面左冠狀靜脈主干為標志，用6/0無創(chuàng)縫合針于左心耳根部下方2 mm處穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁出針，作一活結以結扎左冠脈前降支（除假手術組大鼠不結扎外，其余3組大鼠均結扎），迅速將心臟塞回胸腔，用力擠壓胸腔排空腔內空氣，觀察心電圖，若Ⅱ導聯(lián)下ST段抬高，表明缺血成功；逐層縫合肋骨、肌肉和皮膚，60 min后松結扎線再灌注24 h（心電圖ST段下移50%以上表明心肌組織恢復再灌注）復制心肌MIRI模型[9]。

2.4 心電圖ST段抬高情況

再灌注24 h再次給藥后，觀察并記錄各組大鼠心電圖ST段的變化。

2.5 血漿心肌酶、cTn-I和氧化損傷相關指標的檢測

于末次給藥3 h后，股動脈采血3 mL，加入肝素后以6 000 r/min離心10 min，取上層血漿，保存于-20 ℃冰箱中，備用。嚴格按照相應試劑盒說明書操作，檢測血漿中心肌酶（LDH、CK、CK-MB）、cTn-I和氧化損傷相關指標（NO、SOD）水平。

2.6 心肌組織病理形態(tài)學的觀察

取血后每組各取3只大鼠處死，取出心臟，置于生理鹽水中洗去血液，用濾紙吸干生理鹽水，再放入含20倍組織體積的4%多聚甲醛溶液中脫水固定，取固定24 h的心肌組織進行石蠟包埋，制作5 μm左右的石蠟切片，二甲苯脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色，梯度乙醇脫水，封片，最后在400倍光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學變化。

2.7 心肌梗死率的測定

利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法計算心肌梗死率。將剩余大鼠處死并取出心臟，經(jīng)生理鹽水清洗干凈后，于-20 ℃冷凍20 min，取出切片，置于1%TTC溶液（稱取1 g TTC粉末置于棕色量瓶中，用磷酸鹽緩沖液定容至100 mL，充分溶解，4 ℃避光保存）中，37 ℃水浴避光染色8～10 min，可見缺血灶呈蒼白色，正常組織為紅色肌肉組織。心肌梗死率的計算：心肌梗死率（%）=梗死灶心肌組織質量/心肌組織總質量×100%。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗結果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用Dunnett檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T 3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 葒草花提取物對MIRI模型大鼠心電圖ST段的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心電圖ST段顯著抬高（P<0.01）。與模型組比較，復方丹參片組和葒草花提取物組大鼠心電圖ST段均顯著下移（P<0.05），各組大鼠心電圖的ST段觀察結果見表1。

3.2 葒草花提取物對MIRI模型大鼠血漿中心肌酶和cTn-I釋放的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血漿中LDH、CK、CK-MB、cTn-I水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，復方丹參片組和葒草花提取物組大鼠血漿中LDH、CK、CK-MB、cTn-I水平均顯著降低（P<0.05），提示葒草花提取物可保護心肌細胞膜的完整性，減少LDH、CK、CK-MB、cTn-I的外漏，增強心肌細胞對抗MIRI的能力，各組大鼠血漿中LDH、CK、CK-MB、cTn-I水平的測定結果見表2。

3.3 葒草花提取物對MIRI模型大鼠病理形態(tài)學的影響

HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌組織的絕大部分心肌纖維結構清晰，橫紋清晰可見，心肌細胞胞漿嗜伊紅染色，細胞核結構清晰，心肌纖維相連處可見階梯狀閏盤結構，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠心肌組織中可見以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，心肌纖維處的部分閏盤結構模糊，階梯狀結構不明顯，心肌細胞胞質結構稍疏松、染色稍淡、水腫變性；與模型組比較，復方丹參片組和葒草花提取物組大鼠心肌組織炎癥細胞浸潤減少，心肌缺血所致的水腫減輕，橫紋可見，各組大鼠心肌組織HE染色結果見圖1。

3.4 葒草花提取物對MIRI模型大鼠心肌梗死率的影響

與假手術組比較，模型組大鼠的心肌梗死率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，復方丹參片組和葒草花提取物組大鼠的心肌梗死率顯著降低（P<0.05），各組大鼠心肌組織TTC染色結果見圖2，心肌梗死率測定結果見表3。

3.5 葒草花提取物對MIRI模型大鼠血漿中SOD、NO水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血漿中SOD、NO水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，復方丹參片組和葒草花提取物組大鼠血漿中SOD、NO水平均顯著升高（P<0.05），結果見表4。

4 討論

葒草花是貴州治療心血管疾病的民族用藥特色品種，具有較好的開發(fā)應用前景。本課題組在前期工作中對葒草花有效部位的化學成分、質量標準、藥動學和血清藥物化學等方面進行了研究，為了對進一步探究葒草花抗MIRI的作用機制奠定基礎，本研究采用MIRI大鼠模型研究了葒草花提取物抗MIRI的作用?；谒幬锉晃杖胙撬幬锇l(fā)揮療效的理論基礎，本研究以前期血清藥物化學研究的給藥劑量為參考依據(jù)[4]，并結合預實驗結果以86 g/kg（以生藥量計）為給藥劑量開展了實驗研究。實驗結果顯示，該給藥劑量能夠有效抑制心肌MIRI，在今后的實驗中，筆者也將以此劑量為依據(jù)，同時開展多個劑量下的葒草花藥動學和藥效學研究，構建葒草花的藥動學-藥效學結合模型（即PK-PD模型），以更為全面和準確地了解葒草花的效應隨劑量和時間而變化的規(guī)律。

葒草花是治療心血管疾病的中藥，具有以多成分、多靶點發(fā)揮療效的特點，故本研究選擇目前臨床公認的治療心肌缺血等心血管疾病的有效中藥——復方丹參片作為陽性對照藥來對葒草花的MIRI保護作用進行評價，具有較好的可比性。發(fā)生MIRI時可通過細胞內鈣超載、細胞線粒體能量代謝障礙以及氧自由基損傷等機制，造成心肌細胞損傷或壞死，繼而引發(fā)細胞膜通透性改變，導致心肌細胞胞漿物質（心肌酶和心肌蛋白）釋放入血[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，葒草花提取物能有效減輕MIRI模型大鼠心肌組織炎癥反應和心肌細胞水腫，且能明顯減少血漿中心肌酶（LDH、CK、CK-MB）和心肌蛋白cTn-I的釋放，提示葒草花提取物能夠減輕MIRI所致心肌細胞損傷[11-12]。

氧化應激在MIRI的病理過程中扮演著至關重要的角色[13]。心肌缺血再灌注時，產(chǎn)生過量的活性氧，破壞了機體內的氧化還原平衡系統(tǒng)，使體內抗氧化物質減少，體內氧自由基堆積，生物膜發(fā)生脂質過氧化反應，直接或間接地導致細胞膜的結構和功能損傷，從而加劇缺血心肌的組織損傷及功能障礙。SOD是機體清除自由基的關鍵酶[14]，其將有害的超氧自由基（O2-）轉化為過氧化氫，后者在體內的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的作用下，立即分解為水。生理狀態(tài)下，NO具有較強的舒血管作用，且具有較強的自由基清除作用，能直接滅活氧自由基，阻斷脂膜的自由基鏈式反應，抑制羥自由基的生成，進而減少機體內抗氧化物質SOD 和谷胱甘肽（GSH）的消耗，增加機體抗氧化能力、減少脂質過氧化損傷、提高細胞存活率[15]。本課題組前期對葒草各部位藥理活性進行了篩選，實驗結果發(fā)現(xiàn)，葒草花有比其“全草”更為明顯的抗心肌缺血作用，為葒草的主要藥用有效部位[16]，并且本課題組在葒草花活性部位中分離并鑒定了大量單體化合物，如N-反式-對羥基苯乙基阿魏酰胺、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、槲皮素-3-O-（2″ -O-α-L-鼠李糖基）-β-D-葡萄糖醛酸苷、槲皮苷、N-p-香豆酰酪胺等[17-18]，推測這些成分可能是葒草花發(fā)揮藥效的有效組分群。本研究結果顯示，葒草花提取物給藥后能明顯增加MIRI模型大鼠血漿中的NO含量，升高血清中SOD活力，提示其對心肌細胞的保護作用可能與抗氧化應激損傷有關，這為進一步探究葒草花抗MIRI的保護作用機制提供了實驗依據(jù)，也為葒草花藥用資源的深層次開發(fā)奠定了基礎。但是，葒草花提取物究竟是通過提高心肌細胞清除自由基能力還是抑制逆向 Na+/Ca2+交換，或是通過其他途徑而發(fā)揮的MIRI保護作用還有待進一步研究。

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（收稿日期：2018-06-25 修回日期：2018-11-02）

（編輯：林 靜）