HPLC—PDA法同時(shí)測(cè)定大黃蟄蟲(chóng)丸中6種成分的含量

張桂平 王東旭

中圖分類(lèi)號(hào) R286.0；R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）01-0054-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.12

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定大黃蟄蟲(chóng)丸中苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、大黃素及大黃酚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Welchrom-C18，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm（苦杏仁苷）、230 nm（芍藥苷、黃芩苷）和250 nm[甘草酸（以甘草酸銨計(jì)）、大黃素、大黃酚]，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、大黃素及大黃酚檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為21.028～157.71、12.052～90.390、34.288～257.16、8.252 0～61.890、3.272 0～24.540、4.768 0～35.760 μg/mL（r均≥0.999 2）；檢測(cè)限分別為0.105 0、0.121 0、0.068 6、0.082 5、0.024 6、0.0179 μg/mL；定量限分別為0.263 0、0.362 0、0.171 0、0.268 0、0.065 5、0.047 7 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（12 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均<2.00%（n=6）；加樣回收率分別為96.01%～100.76%、97.09%～101.86%、99.70%～101.99%、96.29%～99.52%、98.47%～102.14%、97.19%～99.16%，RSD分別為1.63%、1.50%、0.82%、1.35%、1.35%、0.69%（n=6）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定大黃蟄蟲(chóng)丸中苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、大黃素及大黃酚的含量。

關(guān)鍵詞 大黃蟄蟲(chóng)丸；苦杏仁苷；芍藥苷；黃芩苷；甘草酸銨；大黃素；大黃酚；高效液相色譜法；含量測(cè)定

Simultaneous Determination of 6 Kinds of Constituent in Dahuang Zhechong Pills by HPLC-PDA

ZHANG Guiping1，WANG Dongxu2（1.Nanyang Institute for Food and Drug Control， Henan Nanyang 473061， China；2.Dept. of Laboratory， Nanyang Second General Hospital， Henan Nanyang 473000， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for amygdalin， paeoniforin， baicalin， glycyrrhizic acid， emodin and chrysophanol in Dahuang zhechong pills. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Welchrom C18 with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and the detection wavelengths were set at 210 nm （amygdalin）， 230 nm （paeoniforin， baicalin） and 250 nm [glycyrrhizic acid （calculated with ammonium glycyrrhizinate）， emodin， chrysophanol]. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of amygdalin，paeonifiorin，baicalin，ammonium glycyrrhizinate， emodin and chrysophanol fell within the ranges of 21.028-157.71，2.052-90.390， 34.288-257.16， 8.252 0-61.890， 3.272 0-24.540，4.768 0-35.760 μg/mL （all r≥0.999 2）. The limits of detection were 0.105 0， 0.121 0， 0.068 6， 0.082 5， 0.024 6， 0.017 9 μg/mL. The limits of quantitation were 0.263 0， 0.362 0， 0.171 0， 0.268 0， 0.065 5， 0.047 7 μg/mL. RSDs of precision， stability（12 h）and reproducibility tests were lower than 2.00% （n=6）. The average recoveries were 96.01%-100.76% （RSD=1.63%，n=6）， 97.09%-101.86% （RSD=1.50%，n=6）， 99.70%-101.99%（RSD=0.82%，n=6），96.29%-99.52%（RSD=1.35%，n=6）， 98.47%-102.14% （RSD=1.35%， n=6） and 97.19%-99.16%（RSD=0.69%，n=6），respectively. CONCLUSIONS： The method is accurate， simple and reproducible for simultaneous determination of amygdalin， paeoniforin， baicalin， glycyrrhizic acid， emodin and chrysophanol in Dahuang zhechong pills.

KEYWORDS Dahuang zhechong pills； Amygdalin；Paeonifiorin；Baicalin；Glycyrrhizic acid；Emodin；Chrysophanol；HPLC； Content determination

大黃蟄蟲(chóng)丸出自張仲景的《金匱要略》，由熟大黃、土鱉蟲(chóng)、水蛭、虻蟲(chóng)、蠐螬、干漆、桃仁、炒苦杏仁、黃芩、地黃、白芍、甘草組成，具有疏通經(jīng)絡(luò)、破瘀生新、緩中補(bǔ)虛、清熱潤(rùn)燥、滋陰養(yǎng)血之功效，臨床上用于治療各種原因引起的肝纖維化、脂肪肝、高脂血癥、肝硬化等病癥，并具有良好的療效[1-3]。桃仁和炒苦杏仁具有活血祛瘀、潤(rùn)腸通便、止咳平喘的作用，其主要成分為苦杏仁苷等；白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的作用，其主要成分為芍藥苷[4]；熟大黃具有活血化瘀的作用，其主要成分為大黃素和大黃酚[5]。為更好地控制大黃蟄蟲(chóng)丸的質(zhì)量，筆者選擇熟大黃中的大黃素和大黃酚、桃仁和炒苦杏仁中的苦杏仁苷、黃芩中的黃芩苷、白芍中的芍藥苷和甘草中的甘草酸（以甘草酸銨計(jì)）作為質(zhì)控成分，建立高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定大黃蟄蟲(chóng)丸中這6種成分的含量，為進(jìn)一步控制大黃蟄蟲(chóng)丸的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（PDA）（日本島津公司）；XS205電子天平（德國(guó)梅特勒-托利多公司）；SK5200H超聲清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：110820-201607，純度：90.7%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201509，純度：96.4%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201318，純度：93.3%）、甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-201116，純度：93.1%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201512，純度：98.7%）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201621，純度：99.2%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；大黃蟄蟲(chóng)丸購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠（批號(hào)：15030078、16050052、15010092）和廣東恒誠(chéng)制藥有限公司（批號(hào)：1505702、1504703、1502701）；甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，23%A；15～18 min，23%→49%A；18～33 min，49%A；33～36 min，49%A→17%A；36～53 min，17%A；43～57 min，17%→77%A）；檢測(cè)器為PDA；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm（苦杏仁苷）、230 nm（芍藥苷、黃芩苷）、250 nm（甘草酸、大黃素、大黃酚）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取苦杏仁苷對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品、大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，用70%甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為苦杏仁苷0.525 7 mg/mL、芍藥苷0.301 3 mg/mL、黃芩苷0.857 2 mg/mL、甘草酸銨0.206 3 mg/mL、大黃素0.081 9 mg/mL和大黃酚0.119 2 mg/mL的對(duì)照品母液。然后精密吸取對(duì)照品母液2 mL，加入20 mL量瓶中，70%甲醇定容，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.2 供試品溶液 取大黃蟄蟲(chóng)丸（批號(hào)：15030078）適量，研細(xì)，精密稱(chēng)定1.2 g置于錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱(chēng)質(zhì)量；浸泡2 h后，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液 按大黃蟄蟲(chóng)丸的處方制法分別制備缺桃仁和炒苦杏仁（即不含苦杏仁苷）、缺黃芩和白芍（即不含芍藥苷、黃芩苷）、缺熟大黃和甘草（即不含甘草酸、大黃素、大黃酚）的陰性對(duì)照品，再按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備各陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液色譜圖中苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃素和大黃酚均在混合對(duì)照品溶液色譜圖相同的保留時(shí)間處有色譜峰，且各峰之間無(wú)干擾，分離度均>1.5，其他成分對(duì)各待測(cè)成分無(wú)干擾。理論板數(shù)以苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃素和大黃酚峰計(jì)均大于5 000。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品母液0.4、0.8、1.2、1.8、2.4、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以6種成分的峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和線性范圍。結(jié)果，6種成分在各檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，6種成分的回歸方程與線性范圍見(jiàn)表1。

2.3.3 檢測(cè)限與定量限檢測(cè) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)得檢測(cè)限；當(dāng)信噪

比為10 ∶ 1時(shí)得定量限。結(jié)果，苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃素和大黃酚檢測(cè)限分別為0.105 0、0.121 0、0.068 6、0.082 5、0.024 6、0.017 9 μg/mL；定量限分別為0.263 0、0.362 0、0.171 0、0.268 0、0.065 5、0.047 7μg/mL。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃素和大黃酚峰面積RSD分別為0.89%、1.08%、0.73%、1.47%、1.32%、0.79%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取大黃蟄蟲(chóng)丸（批號(hào)：15030078）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為1.32%、1.56%、0.84%、1.62%、1.03%、0.79% （n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大黃蟄蟲(chóng)丸（批號(hào)：15030078）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、3、6、9、12 h后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，苦杏仁、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃素和大黃酚的峰面積的RSD分別為1.15%、0.97%、0.79%、1.49%、0.92%、1.38%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量（苦杏仁苷1.615 mg/g、芍藥苷0.833 mg/g、黃芩苷2.627 mg/g、甘草酸銨0.636 mg/g、大黃素和大黃酚為0.783 mg/g）的大黃蟄蟲(chóng)丸0.6 g，平行6份，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品母液各2 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果，苦杏仁、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃素和大黃酚的加樣回收率分別為96.01%～100.76%、97.09%～101.86%、99.70%～101.99%、96.29%～99.52%、98.47%～102.14%、97.19%～ 99.16%，RSD分別為1.63%、1.50%、0.82%、1.35%、1.35%、0.69%（n=6），加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.8 樣品含量測(cè)定 取6批大黃蟄蟲(chóng)丸適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量。樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

中藥材和中藥復(fù)方成分種類(lèi)復(fù)雜，研究中常會(huì)碰到同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分且各成分的最大紫外吸收波長(zhǎng)不同的問(wèn)題[6-7]。本試驗(yàn)對(duì)苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、大黃素及大黃酚進(jìn)行全波長(zhǎng)（190～400 nm）掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)分別為210、230、278、250、253、256 nm，差別較大，故本文在滿(mǎn)足含量測(cè)定要求的前提下，綜合考慮到峰形、分離度、方法簡(jiǎn)便性等因素，最終確定苦杏仁苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，芍藥苷和黃芩苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，甘草酸銨、大黃素和大黃酚的檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。結(jié)果，在上述3個(gè)波長(zhǎng)處同時(shí)測(cè)定大黃蟄蟲(chóng)中6種成分可避免雜質(zhì)干擾且靈敏度高。

3.2 提取溶劑的選擇

筆者參考文獻(xiàn)[8-11]方法考察了30%、70%甲醇和30%、70%乙醇作為溶劑對(duì)樣品的提取效果。結(jié)果，以70%甲醇作為溶劑，其提取率相對(duì)較高，且雜質(zhì)干擾較少，故本研究選擇70%甲醇為提取溶劑。

3.3 流動(dòng)相的的選擇

筆者在預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中參考文獻(xiàn)[12-16]方法，選用乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水、甲醇-1%磷酸流動(dòng)相體系對(duì)各成分進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入一定比例的磷酸有助于提高待測(cè)成分與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度；但當(dāng)以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相時(shí)甘草酸銨峰附近雜質(zhì)峰較多，分離效果差，當(dāng)以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相其分離效果最佳，峰形最好，故本研究選擇甲醇-0.1%磷酸溶液體系為流動(dòng)相。

3.4 含量結(jié)果分析

本文對(duì)2個(gè)廠家6批大黃蟄蟲(chóng)丸中的苦杏仁苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、大黃素及大黃酚的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，不同廠家中各成分含量均不同，但同一廠家不同批號(hào)之間的含量差異相對(duì)較小，這可能與藥材來(lái)源的多元性、品質(zhì)的優(yōu)劣及廠家之間的生產(chǎn)工藝和設(shè)備不同等因素有較大關(guān)系，進(jìn)一步提示考察大黃蟄蟲(chóng)丸中6種成分含量的重要性。

綜上，本研究建立了HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定大黃蟄蟲(chóng)丸中6種成分的含量，可為大黃蟄蟲(chóng)丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-08-30 修回日期：2018-11-09）

（編輯：唐曉蓮）