廣藿香酮傳遞體的制備及質(zhì)量評價(jià)

馬麗娜 吳智敏 楊暢 郭淑娟 陳麗萍 喬延江 史新元

中圖分類號 R944 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0050-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.11

摘 要 目的：制備廣藿香酮傳遞體并對其質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。方法：采用薄膜分散法制備廣藿香酮傳遞體；以廣藿香酮的累積透過量（Qn）、累積透過率（PR）為評價(jià)指標(biāo)，篩選處方中表面活性劑種類、表面活性劑用量及廣藿香酮用量；以最優(yōu)處方制備廣藿香酮傳遞體，觀察其形態(tài)、粒徑分布和Zeta電位并測定包封率。結(jié)果：廣藿香酮傳遞體的最優(yōu)處方為表面活性劑為膽酸鈉，膽酸鈉用量為0.25 g，廣藿香酮用量為15 mg。最優(yōu)處方制備的廣藿香酮傳遞體呈乳白色混懸液，其平均粒徑為（115.6±3.65） nm（RSD=3.20%，n=3），多分散系數(shù)（PDI）為0.185±0.008（RSD=4.30%，n=3），Zeta電位為（-13.76±0.225） mV（RSD=1.70%，n=3），廣藿香酮的包封率為（46.01±0.40）%（RSD=0.87%，n=3），Qn為（378.76±0.61） μg/cm2（RSD=0.20%，n=3），PR為（89.02±0.96）%（RSD=1.10%，n=3）。結(jié)論：制備的廣藿香酮傳遞體質(zhì)量符合要求，可為后續(xù)廣藿香酮新劑型的研究提供參考。

關(guān)鍵詞 廣藿香酮；傳遞體；薄膜分散法；制備；包封率；質(zhì)量評價(jià)；累積透過量

Preparation and Quality Evaluation of Pogostone Transfersomes

MA Lina1，2，WU Zhimin1，2，YANG Chang1，GUO Shujuan1，CHEN Liping1，QIAO Yanjiang1，2，SHI Xinyuan1，2（1.School of Chinese Materia Medica， Beijing University of TCM， Beijing 102488， China；2.Dept. of TCM Information， School of TCM， Beijing University of TCM， Beijing 102488， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare pogostone transfersomes， and to evaluate its quality. METHODS： Film dispersion method was used to prepare pogostone transfersomes. Using the accumulative penetration volume （Qn） and accumulative penetration ratio （PR） of pogostone as evaluation indexes， the types of surfactant， formulation were screened in respects of the dosage of surfactant and the dosage of pogostone. The pogostone transfersomes were prepared with optimal formulation； the morphology， particle size distribution and Zeta potential were observed and the entrapment efficiency was measured. RESULTS： The optimal formulation was as follows as the sodium cholate was selected as surfactant； the dosage of sodium cholate was 0.25 g； the dosage of pogostone was 15 mg. The optimal pogostone transfersomes were ivory-white suspension； average particle size was （115.6±3.65） nm （RSD=3.20%，n=3）； PDI was 0.185±0.008 （RSD=4.30%， n=3）； Zeta potential was （-13.76±0.225） mV （RSD=1.70%，n=3）； entrapment efficiency of pogostone was （46.01±0.40）% （RSD=0.87%，n=3）； Qn was （378.76±0.61） μg/cm2 （RSD=0.20%，n=3）； PR was （89.02±0.96）% （RSD=1.10%，n=3）. CONCLUSIONS： Prepared pogostone transfersomes are in line with quality requirements， which can provide reference for the further study of new dosage form of pogostone.

KEYWORDS Pogostone； Transfersome； Film dispersion method； Preparation； Entrapment efficiency； Quality evaluation； Accumulative penetration volume

廣藿香是唇形科植物廣藿香[Pogostemoncablin （Blanco） Benth.]的干燥地上部分，為四大南藥之一，味辛、微溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有芳香化濁、和中止嘔、發(fā)表解暑的功效[1]。廣藿香酮是廣藿香的主要有效成分之一，在體外抗真菌試驗(yàn)中，廣藿香酮對癬菌和白色念珠菌均有明顯的抑菌和殺菌效果[2]。目前，廣藿香酮市售與在研劑型包括膜劑、巴布劑等經(jīng)皮給藥制劑，憑借其獨(dú)特優(yōu)勢（方便快捷、避免首關(guān)效應(yīng)等）在藥物制劑領(lǐng)域越來越受到重視[3]；但由于皮膚的屏障作用，經(jīng)皮給藥往往存在滲透速率低的問題，因此，研究者也一直在嘗試新的技術(shù)來改善藥物的皮膚滲透性。

傳遞體又稱為柔性納米脂質(zhì)體或變形脂質(zhì)體，是在脂質(zhì)體中加入了表面活性劑（如膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、聚山梨酯80等）制備而成，與傳統(tǒng)脂質(zhì)體相比，傳遞體具有高度變形性及水化梯度驅(qū)動(dòng)力，更易傳遞藥物進(jìn)入皮膚[4]，因此，傳遞體的開發(fā)為經(jīng)皮給藥制劑的研究提供了一個(gè)更廣闊的領(lǐng)域。

本文以廣藿香酮的累積透過量（Qn）和累積透過率（RP）為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化廣藿香酮傳遞體的處方，并在此基礎(chǔ)上對優(yōu)化處方制備的廣藿香酮傳遞體進(jìn)行了質(zhì)量評價(jià)，以期為廣藿香酮的經(jīng)皮給藥新劑型提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS110S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱、恒溫振蕩器（上海一恒科技有限公司）；Liposofast-basic脂質(zhì)體擠出器（加拿大Avestin公司）；ZetaNano粒徑分析儀（英國Malvern公司）；TP-6透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（天津市鑫洲科技有限公司）；1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；JEM-1230透射電鏡（日本Jeol公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

廣藿香酮對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：ST07461020MG，純度：≥98%）；大豆卵磷脂、膽酸鈉（批號：C10082496、C10074114）均購自上海麥克林生化科技有限公司；脫氧膽酸鈉、聚山梨酯80（批號：T16O8Q45848、Z12M8Y35944）均購自上海源葉生物科技有限公司；維生素E（北京夢怡美生物科技有限公司，批號：20160419V114）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，♂，體質(zhì)量180 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）20160002。每日早晚喂食，自由攝食飲水，明暗交替模擬白天和黑夜，室溫飼養(yǎng)，濕度為50%左右。

2 方法與結(jié)果

2.1 廣藿香酮傳遞體的制備

（1）廣藿香酮傳遞體：稱取處方量的大豆卵磷脂、表面活性劑、維生素E及廣藿香酮對照品，以無水乙醇溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)溶劑（50 r/min，40 ℃）形成淺黃色均勻干薄膜，40 ℃真空干燥過夜除去痕量的溶劑，然后加入預(yù)熱的生理鹽水10 mL，恒溫振蕩器振搖使其充分水化（200 r/min，40 ℃），室溫下溶脹2 h，擠壓依次通過0.45、0.22 μm的微孔濾膜及100 nm的聚碳酸酯膜，即得廣藿香酮傳遞體，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。（2）空白廣藿香酮傳遞體：按上述方法制備不加廣藿香酮對照品的空白傳遞體。

2.2 廣藿香酮含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（60 ∶ 40，V/V）；檢測波長為310 nm；流速為1 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱量廣藿香酮對照品5 mg置于5 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品母液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取“2.1”項(xiàng)下廣藿香酮傳遞體混懸液200 μL，甲醇稀釋至2 mL，超聲30 min（功率：200 W，頻率：45 kHz，下同），搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 精密吸取“2.1”項(xiàng)下空白傳遞體混懸液200 μL，甲醇稀釋至2 mL，超聲30 min，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，得陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)下溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，廣藿香酮對照品溶液和供試品溶液在各自圖譜上相應(yīng)位置出峰，且無其他雜質(zhì)干擾。理論板數(shù)按廣藿香酮峰計(jì)不低于3 000，陰性樣品溶液在相應(yīng)位置未見出峰，表明采用該色譜條件測定廣藿香酮專屬性良好。高效液相色譜圖見圖1。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下溶液，加入甲醇制備成廣藿香酮終質(zhì)量濃度為118、59、29.5、11.8、1.18 μg/mL的系列溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積（y）對廣藿香酮的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=49 117x+4 577.7（R2=0.999 6），表明廣藿香酮在檢測質(zhì)量濃度1.18～118 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.7 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果，在精密度試驗(yàn)中，廣藿香酮峰面積的RSD為0.21%（n=6），表明儀器精密度良好；在重復(fù)性試驗(yàn)中，廣藿香酮峰面積的RSD為1.1%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好；在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，廣藿香酮含量的RSD為1.3%（n=6），表明樣品在7 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知質(zhì)量濃度的傳遞體供試品溶液9份，分別精密加入相應(yīng)量的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的廣藿香酮對照品溶液，用甲醇稀釋定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，低質(zhì)量濃度下的加樣回收率為102.1%（RSD=1.3%，n=9）；中質(zhì)量濃度下的加樣回收率為103.1%（RSD=1.3%，n=9）；高質(zhì)量濃度下的加樣回收率102.3%（RSD= 1.4%，n=9），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 廣藿香酮傳遞體體外經(jīng)皮試驗(yàn)

2.3.1 離體皮膚制備 取大鼠，乙醚麻醉處死，置于解剖盤中，固定四肢，暴露腹部，用電動(dòng)剃毛器對腹部脫毛（注意不傷及角質(zhì)層）[5]，將脫毛后的皮膚剪下，棉球擦拭除去多余的脂肪組織，4 ℃保存，備用，在1周內(nèi)用完。

2.3.2 經(jīng)皮滲透試驗(yàn) 采用改良的Franz擴(kuò)散池裝置，將大鼠腹部皮膚固定于供給池與接收池之間（擴(kuò)散面積3.14 cm2，接收池體積18 mL），角質(zhì)層面向供給池，選擇50%乙醇作為接收液。供給池保持32 ℃恒溫水浴，池內(nèi)磁力攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min，平衡10 min后，更換新的接收液。在供給池一側(cè)分別加入2 mL不同處方制備的廣藿香酮傳遞體，分別在21 h（經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該時(shí)間點(diǎn)的Qn最大）取樣1 mL，每次取樣后補(bǔ)充1 mL的接收液。用0.22 μm微孔濾膜過濾所取樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，并計(jì)算廣藿香酮的質(zhì)量濃度。計(jì)算廣藿香酮的Qn和PR，其中，Qn=[cnV+[∑][i=1][n-1]ciVi

A] （cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物質(zhì)量濃度，V為接收池體積；ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度，Vi為取樣體積，A為皮膚的有效擴(kuò)散面積）；PR=Qn/M（M為皮膚單位面積初始載藥量）。

2.4 廣藿香酮傳遞體的處方優(yōu)化

2.4.1 正交試驗(yàn) 影響傳遞體質(zhì)量的主要因素包括磷脂和表面活性劑的種類、磷脂與表面活性劑的用量、磷脂與藥物的比率、膽固醇的含量以及帶電介質(zhì)的引入等[6-9]。筆者綜合前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇表面活性劑種類（A）、表面活性劑用量（B）和廣藿香酮用量（C）3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，為了使各組間傳遞體囊材總質(zhì)量的一致性，筆者將大豆卵磷脂和表面活性劑的總用量控制為1 g，處方中維生素E的用量設(shè)定為2 mg。以廣藿香酮的Qn和PR為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)化處方。因素與水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

C，因素B、A對PR有顯著影響，最優(yōu)處方為A1B3C3。分別以廣藿香酮的Qn和PR為指標(biāo)篩選出的最優(yōu)處方均為A1B3C3，故選此為最優(yōu)處方，即選取膽酸鈉為表面活性劑，膽酸鈉用量為0.25 g，廣藿香酮用量為15 mg。

2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)最優(yōu)處方制備3批樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行經(jīng)皮試驗(yàn)并測定廣藿香酮的Qn和PR。結(jié)果，最優(yōu)處方制備的廣藿香酮傳遞體Qn為（378.76±0.61） μg/cm2（RSD=0.2%，n=3），PR為（89.02±0.96）%（RSD=1.1%，n=3），提示該處方下廣藿香酮傳遞體經(jīng)皮透過量較穩(wěn)定。

2.5 廣藿香酮傳遞體的質(zhì)量評價(jià)

2.5.1 外觀形態(tài) 取“2.4.2”項(xiàng)下制備的廣藿香酮傳遞體適量，蒸餾水稀釋，然后取1滴置于特制銅網(wǎng)上，靜置5 min，再用1%磷鎢酸負(fù)染，并用濾紙去多余染液，于透射電鏡下觀察拍照。結(jié)果，廣藿香酮傳遞體為乳白色混懸液，久置有輕微分層現(xiàn)象；透射電鏡下觀察為大小不一的囊泡，小囊泡多呈球形，大囊泡大多呈不規(guī)則橢圓球形，表明制備的廣藿香酮傳遞體符合要求。廣藿香酮傳遞體透射電鏡圖見圖2。

2.5.2 粒徑與Zeta電位 取“2.4.2”項(xiàng)下制備的廣藿香酮傳遞體各1 mL，用生理鹽水稀釋10倍，以粒徑分析儀測定其粒徑及Zeta電位。結(jié)果，廣藿香酮傳遞體的平均粒徑為（115.6±3.65） nm（RSD=3.20%，n=3），多分散性系數(shù)（PDI）為0.185±0.008（RSD=4.30%，n=3），表明廣藿香酮傳遞體的粒徑分布比較均勻；Zeta電位為（-13.76±0.225） mV（RSD=1.70%，n=3），表明廣藿香酮傳遞體表面帶荷負(fù)電，可提高傳遞體的分散性，有利于其穩(wěn)定性。

2.5.3 包封率 采用超濾離心法測定廣藿香酮傳遞體的包封率[10-11]。取“2.4.2”項(xiàng)下制備的廣藿香酮傳遞體300 μL于2 mL超濾離心管中，4 000 r/min離心10 min，不更換超濾單元，重復(fù)上述操作2次，取最后一次上清液20 μL，稀釋到一定倍數(shù)后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定游離藥物的含量，再計(jì)算包封率。包封率=（傳遞體中廣藿香酮藥物總量-游離藥物含量）/傳遞體中廣藿香酮藥物總量×100%。結(jié)果，優(yōu)化處方制備的廣藿香酮傳遞體的包封率為（46.01±0.40）%（RSD=0.87%，n=3）。

3 討論

傳遞體常用的制備方法有很多，其中薄膜分散法操作簡單，重復(fù)性好，且去除有機(jī)溶劑較徹底，常用于脂溶性藥物的研究。因此，筆者選擇薄膜分散法作為廣藿香酮傳遞體的制備方法，以Qn和PR為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化廣藿香酮傳遞體的處方，篩選出了最優(yōu)處方為表面活性劑為膽酸鈉，膽酸鈉用量為0.25 g，廣藿香酮用量15 mg。優(yōu)化后處方制備的廣藿香酮傳遞體粒徑分布均勻，Zeta電位小于-10 mV，符合混懸液穩(wěn)定性的粒徑和電位要求[10]。

表面活性劑的種類和用量[12-13]對傳遞體性質(zhì)影響較大。筆者選用的膽酸鈉與脫氧膽酸鈉為離子型表面活性劑，聚山梨酯80為非離子型表面活性劑，最終根據(jù)處方優(yōu)化篩選出的最優(yōu)表面活性劑為膽酸鈉。前期預(yù)試驗(yàn)采用聚山梨酯80制備的傳遞體電位為-2 mV左右，其余兩種離子型表面活性劑的傳遞體電位均小于-10 mV。表面活性劑用量是決定傳遞體變形性的主要因素，用量太低，傳遞體變形性不足；而用量太高，傳遞體結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞[14]。本試驗(yàn)優(yōu)化后的膽酸鈉用量為0.25 g，其與大豆卵磷脂的比例為1 ∶ 3，使得傳遞體具有較高的變形性，可促進(jìn)藥物較快、較多地滲透。

廣藿香酮為親脂性藥物，最優(yōu)處方制備的廣藿香酮傳遞體包封率不高，相關(guān)研究如魏燕等[15]測定了親脂性藥物青藤堿傳遞體的包封率，其包封率也僅僅為39.8%，同樣存在經(jīng)皮透過率高但包封率不高的現(xiàn)象；也有研究表明未被包封于傳遞體中的游離藥物可通過與脂質(zhì)囊泡結(jié)合的方式以高速率隨囊泡進(jìn)入皮膚，即封閉效應(yīng)[16]。

本試驗(yàn)優(yōu)化了廣藿香酮傳遞體的處方，所制備的廣藿香酮傳遞體穩(wěn)定性較好，質(zhì)量符合要求，可為后續(xù)廣藿香酮新劑型的研究提供參考。

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（收稿日期：2018-07-09 修回日期：2018-10-26）

（編輯：唐曉蓮）