吉產(chǎn)不同生長年限人參中8種主要人參皂苷與人參皂苷Rg1比值的變化規(guī)律研究

余江鋒 李育平 何偉 楊劍湖 貝偉劍 郭姣

中圖分類號 R931.5；R932 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0031-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.07

摘 要 目的：探討吉產(chǎn)不同生產(chǎn)年限人參中8種主要人參皂苷與人參皂苷Rg1的比值的變化規(guī)律，為其生長年限的鑒別提供參考。方法：收集吉林省不同生長年限（3～30年）的園參、林下參、野山參樣品，采用高效液相色譜法（HPLC）測定人參中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 等8種成分的含量；計算各皂苷單體含量及8種人參皂苷總含量分別與人參皂苷Rg1含量的比值，并探究該比值與生長年限的關(guān)系。結(jié)果：隨人參生長年限的增長，園參中8種人參皂苷總含量與人參皂苷Rg1的比值及人參皂苷Re、Rb1、Rc、Rd單體含量與人參皂苷Rg1的比值均逐漸減?。≒<0.001），林下參中人參皂苷Re與人參皂苷Rg1的比值呈先減小后增加趨勢（P<0.001），野山參中8種人參皂苷總含量與人參皂苷Rg1的比值及人參皂苷Re、Rb1與人參皂苷Rg1的比值均逐漸增加（P<0.001），而園參、林下參、野山參中人參皂苷Rf、Rb3與人參皂苷Rg1的比值則均無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論：園參、林下參、野山參均含有8種人參皂苷成分，可根據(jù)人參皂苷Rg1含量和人參皂苷Re、Rb1單體含量與人參皂苷Rg1的比值初步推測其生長年限。

關(guān)鍵詞 吉林??；人參；生長年限；人參皂苷

Study on the Proportion Regularity of 8 Kinds of Ginsenoside to Ginsenoside Rg1 in Panax ginseng of Different Growth Years in Jilin Province

YU Jiangfeng1，LI Yuping1，HE Wei1，YANG Jianhu2，BEI Weijian1，GUO Jiao1[1.Institute of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University/Guangdong Metabolic Diseases Research Center of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Guangzhou 510006， China；2.Sinopharm Group Fengliaoxing （Foshan） Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangdong Foshan 528000， China]

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the proportion of 8 kinds of ginsenoside to ginsenoside Rg1 in Panax ginseng and the regularity of growth year in Jilin province， and to provide reference for the identification of growth year. METHODS： The samples of garden ginseng， wild-cultivated ginseng and wild ginseng were collected from different growth years （3-30 years） in Jilin province. The contents of 8 ginsenoside （ginsenoside Rg1， Re， Rf， Rb1， Rc， Rb2， Rb3， Rd） in P. ginseng were determined by HPLC. The contents of saponins as well as the proportion of 8 kinds of ginsenoside to ginsenoside Rg1 were calculated； the relationship of the proportion with growth year was investigated. RESULTS： As the increase of growth year， the proportion of 8 kinds of ginsenosides in garden ginseng to ginsenoside Rg1 as well as that of ginsenoside Re， Rb1， Rc， Rd to ginsenoside Rg1 were decreased gradally （P<0.001）； the proportion of ginsenoside Re to ginsenoside Rg1 in wild-cultivated ginseng decreased first and then increased（P<0.001）； the proportion of 8 kinds of ginsenosides to ginsenoside Rg1 as well as the proportion of ginsenoside Re and Rb1 to ginsenoside Rg1 were increased gradually in wild ginseng （P<0.001）； the proportion of ginsenoside Rf， Rb3 to ginsenoside Rg1 in garden ginseng， wild-cultivated ginseng and wild ginseng had no significant difference（P>0.05）. CONCLUSIONS： Garden ginseng， wild-cultivated ginseng and wild ginseng contain 8 kinds of ginsenosides. The growth year can be predicted preliminarily according to the proportion of ginsenoside Rg1 and ginsenoside Re， Rb1 to ginsenoside Rg1.

KEYWORDS Jilin province； Panax ginseng； Growth years； Ginsenoside

人參是五加科（Araliaceae）植物人參（Panax ginseng C.A.Meyer.）的干燥根和根莖，人工載培于園地的稱“園參”，播種在山林自然生長的稱“林下參”，而自然傳播、野生狀態(tài)下生長于深山密林的稱“野山參”。人參具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益腎、生津養(yǎng)血、安神益智之功效[1]。有研究表明，人參皂苷具有提高人體免疫力、促進物質(zhì)代謝、改善心血管功能、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等多種作用[2-4]?，F(xiàn)已知的人參皂苷單體有50余種，其中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd是人參的主要活性成分，其質(zhì)量分數(shù)占人參總皂苷的90%以上[5-6]。因人參是貴重藥材，且存在不同產(chǎn)地、不同生長年限和不同藥用部位等區(qū)分，國內(nèi)外對人參的研究較多，但多集中于測定方法、藥理活性、生物轉(zhuǎn)化等方面[7]，而通過各單體人參皂苷之間的比例對人參進行分析的研究尚未見文獻報道。本文筆者收集和鑒定了吉產(chǎn)3～30年的不同人參樣品，包括園參、林下參、野山參，測定了人參樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd等8種主要成分的含量。由于人參皂苷Rg1在對人體的神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)方面有很強的藥理活性[8-9]，因此筆者設(shè)計以人參皂苷Rg1含量為分母，計算各人參皂苷含量與人參皂苷Rg1含量的比值，探討該比值與人參生長年限的變化規(guī)律，以期為園參、林下參、野山參生長年限的鑒別和質(zhì)量鑒識提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Elmasonic P 300 H超聲波清洗器（德國Elma公司）；BT224S萬分之一與BT125D十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與藥材

人參皂苷Rg1（批號：110703-201731，純度：93.6%）、Re（批號：110754-201626，純度：97.4%）、Rf（批號：111719-201505，純度：98%）、Rb1（批號：110704-201625，純度：95.0%）、Rb2（批號：111715-201203，純度：93.8%）、Rb3（批號：111686-201504，純度：97.0%）、Rd（批號：111818-201302，純度：94.2%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rc對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-12052705，純度：98%）；甲醇、乙腈（德國Merck公司，色譜純）；其他試劑均為分析純，超純水由Veolia水處理系統(tǒng)制得（英國ELGA公司）。15批次人參藥材樣品均產(chǎn)自吉林省白山市撫松縣，購自吉林省參源商貿(mào)有限公司，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院曾令杰教授鑒定，確定為五加科植物人參（Panax ginseng C. A. Mey.）的干燥根和根莖，具體來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1 247.44 μg、Re 271 μg、Rf 103.9 μg、Rb1 594.9 μg、Rc 323.2 μg、Rb2 213.2 μg、Rb3 61.5 μg、Rd 70.8 μg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取樣品S4人參粉末（過4號篩）約1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，加入70%甲醇20 mL，超聲（功率：300 W，頻率：37 kHz）處理50 min，濾過，置于25 mL量瓶中，濾渣用70%甲醇洗滌，并定容至刻度，搖勻，續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 空白對照溶液 取70%甲醇溶劑適量經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 人參藥材中8種人參皂苷成分的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil M05CLA15-C18（150 mm×4.6 mm，5.0 μm），Phenomenex KJ0-4282預(yù)柱；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：0～15 min 19%A，15～25 min 19%～20%A，25～45 min 20%～31%A，45～55 min 31%～35% A，55～65 min 35%～40%A，65～66 min 40%～19%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL。該色譜條件下，理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計應(yīng)不低于6 000。取“2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液進樣分析，結(jié)果顯示，供試品溶液中8種人參皂苷成分均可被檢測出，且分離度均在1.5以上，空白對照對其測定無干擾，色譜圖見圖1。

2.2.2 線性關(guān)系 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液1、2.5、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進行回歸分析，結(jié)果見表2。

2.2.3 檢測限與定量限 取8種人參皂苷單一對照品溶液適量，用甲醇分別按照一定的比例進行稀釋，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1 時得檢測限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1 時得定量限。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的檢測限分別為1.732、1.951、0.374、0.793、0.515、0.895、0.275、0.708 μg/mL，定量限分別為4.949、5.366、0.623、1.586、0.776、1.492、0.615、1.848 μg/mL。

2.2.4 精密度 取人參樣品（S4）的供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，人參樣品中的人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd峰面積的RSD分別為0.43%、0.44%、1.16%、0.35%、0.38%、0.49%、1.89%、0.71%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性 取人參樣品（S4）的供試品溶液，在室溫避光環(huán)境下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，人參樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd峰面積的RSD分別為0.54%、0.50%、2.98%、1.60%、2.68%、1.90%、0.68%、1.59%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性 取人參樣品（S4）粉末（過4號篩）1 g，平行6份，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果顯示，人參樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的平均含量分別為4.69、3.53、1.28、5.86、4.78、3.19、0.38、1.05 mg/g（n=6），峰面積的RSD分別為0.91%、1.23%、2.09%、1.05%、1.39%、1.64%、2.53%、1.80%（n=6），表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.2.7 準(zhǔn)確度 取已知含量的人參粉末0.5 g，平行6份，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，分別加入8種人參皂苷對照品溶液（對照品加入量與樣品中待測成分量之比為1 ∶ 1），按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以測定值與真實值的比值計算回收率。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好，回收率結(jié)果見表3。

2.2.8 樣品含量 先按2015年版《中國藥典》（一部）中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[1]測定15批人參藥材中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量，以百分含量（%）表示，以判斷15批人參藥材是否符合《中國藥典》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。再分別取各批次人參藥材粉末（過4號篩）1 g，精密稱定，平行3份，按照“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定其中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的含量，由于部分人參皂苷單體含量較少，故統(tǒng)一以質(zhì)量濃度（mg/g）表示。15批人參藥材中8種人參皂苷含量測定結(jié)果見表4。

從表4結(jié)果可以看出，15批人參藥材中均含有8種人參皂苷成分，其中人參皂苷Rg1與Re含量之和不低于0.30%、Rb1含量不低于0.20%，均符合2015年版《中國藥典》一部中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。從8種人參皂苷成分的含量結(jié)果可以看出，園參與野山參中人參皂苷Rg1含量隨生長年限的增長而逐漸增加，野山參中人參皂苷Rg1含量在生長年限滿11年后趨于穩(wěn)定；林下參中人參皂苷Rg1含量隨生長年限的增長先增加后減少，其中生長年限為13～14年時人參皂苷Rg1含量達峰值。

從表6結(jié)果可以看出，隨生長年限的增長，林下參中人參皂苷Re與Rg1的比值呈先減小后增加趨勢（P<0.001），生長年限15年為轉(zhuǎn)折點。其中12年以下林下參的人參皂苷Rg1含量<4.00 mg/g且Re/Rg1≥0.90、 Rb1/Rg1>1.60；13年以上林下參的人參皂苷Rg1含量≥4.00 mg/g且Re/Rg1≥0.75、Rb1/Rg1>1.60。8～18年的林下參中人參皂苷Rf、Rb3與人參皂苷Rg1的比值均無明顯變化（P>0.05）。

從表7結(jié)果可以看出，隨生長年限的增長，野山參中8種皂苷總量與Rg1的比值及人參皂苷Re、Rb1與Rg1的比值均逐漸增加（P<0.001）。其中8～15年野山參的人參皂苷Rg1含量≥4.30 mg/g且Re/Rg1<0.60、1.30< Rb1/Rg1<1.85；15年以上野山參的人參皂苷Rg1含量≥4.50 mg/g且Re/Rg1≥0.60、Rb1/Rg1≥1.85。8～30年的野山參中人參皂苷Rf、Rb3與人參皂苷Rg1的比值均無明顯變化（P>0.05）。

3 討論

供試品溶液制備方法對含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確度有很大的影響，故筆者在前期試驗中首先對供試品溶液制備方法進行了優(yōu)化，比較了傳統(tǒng)的煎煮法[10]、熱回流法[11]以及藥典方法[1]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用70%甲醇超聲提取，人參皂苷提取率與熱回流法比較差異無明顯變化，但超聲提取法較熱回流法提取液雜質(zhì)少，色譜峰分離效果好，且操作簡便、高效。與2015年版《中國藥典》方法和煎煮法比較，70%甲醇超聲提取時人參皂苷提取率較高?？疾焐V條件時，筆者先按2015年版《中國藥典》（一部）中人參皂苷含量測定條件進行測定，結(jié)果不僅分析時間長達100 min，且色譜峰Rg1與Re、Rb2與Rb3的分離效果還不理想；然后嘗試按文獻[12]中方法在流動相中添加磷酸，結(jié)果各成分分離度仍未達到1.5；最終確定以本文中色譜條件進行梯度洗脫，檢測波長為203 nm，柱溫為35 ℃時，在60 min內(nèi)就能實現(xiàn)8種人參皂苷成分的良好分離。

目前，人參藥材生長年限的鑒別主要有外觀性狀的觀察、分子生物學(xué)基因測序以及化學(xué)分析人參皂苷含量高低[13]等方法。其中外觀性狀鑒別需要保存完整的人參樣品，而對于人參藥材飲片或制成粉末的樣品，則難以從外觀性狀上鑒別其生長年限；利用分子生物學(xué)技術(shù)測定不同生長年限人參的基因序列，其成本高且效率低；從人參皂苷含量測定結(jié)果來看，人參總皂苷或單個皂苷成分含量與人參生長年限的變化規(guī)律并不統(tǒng)一，僅通過人參皂苷含量測定亦不能很好地鑒別人參藥材的生長年限。本課題組在對不同生長年限人參的研究中發(fā)現(xiàn)，人參中8種皂苷總量（Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd）以及人參皂苷Re、Rb1、Rc、Rd單體含量分別與人參皂苷Rg1含量的比值與生長年限呈一定的變化規(guī)律，且不同種類人參該比值存在顯著差異。本文主要就3～30年吉產(chǎn)園參、林下參、野山參中8種人參皂苷成分含量與人參皂苷Rg1含量比值進行分析，考慮到人參皂苷Rb1、Re和Rg1是人參藥效的重要活性成分且其含量相對較高，因此重點探討了Rb1/Rg1、Re/Rg1與人參種類、生長年限的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)園參、林下參及野山參中Rb1/Rg1、Re/Rg1與其生長年限之間呈現(xiàn)一定的規(guī)律，可為初步鑒定園參、林下參及野山參的生長年限提供參考依據(jù)，特別是為市場上流通的人參飲片、粉末規(guī)格樣品的年限鑒別提供一種新的方法。

此外，本課題組后續(xù)將繼續(xù)收集并檢測更多批次人參藥材進行該比值的分析，積累更多試驗數(shù)據(jù)，完善利用該比值鑒定生長年限的方法，為不同種類、不同生長年限人參藥材的質(zhì)量與人參制劑藥效評價提供參考。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：8-9.

[ 2 ] 王國麗，李曉嬌，張力娜，等.人參皂苷Rb1、Rg1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用及相關(guān)機制的研究進展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2017，51（3）：92-95.

[ 3 ] YANG N，ZHANG S，YANG S，et al. The inhibition of α- glycosidase and protein tyrosine phosphatase 1B （PTP1B） activities by ginsenosides from Panax ginseng，C.A. Meyer and simultaneous determination by HPLC-ELSD[J]. Journal of Functional Foods，2016.DOI：10.1016/j.jff.2015.12. 018.

[ 4 ] 趙琛，蘇光悅，趙余慶，等.人參皂苷及其衍生物抗結(jié)腸癌作用及機制的研究進展[J].中草藥，2015，46（16）：2477- 2483.

[ 5 ] 李慧，許亮，溫美佳，等.不同產(chǎn)地人參皂苷成分含量UPLC法測定及質(zhì)量評價[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（6）：1963-1968.

[ 6 ] 王和宇，徐芳菲，王國明，等.人參莖葉中提取分離人參皂苷F2、Rg1、Rb1、Rb2、Rb3單體化合物的方法[J].人參研究，2018，30（1）：12-14.

[ 7 ] 李蕾，謝麗娟，王國明，等.人參、西洋參不同部位提取物中14種皂苷含量比較[J].人參研究，2018，30（3）：11-13.

[ 8 ] 安明，趙國君，韋新成，等.人參皂苷Rg1保護心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理活性研究進展[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2012，28（1）：75-77.

[ 9 ] 楊娜，周柏松，王亞茹，等.人參皂苷Rg1生物活性研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（4）：1463-1465.

[10] 徐秋香，郁紅禮，吳皓，等.四君子湯傳統(tǒng)煎煮規(guī)范化研究[J].中成藥，2013，35（6）：1325-1329.

[11] 石麗霞，耿琍.正交試驗法篩選人參皂苷提取工藝的研究[J].特產(chǎn)研究，2006，28（2）：18-21.

[12] 馮素香，李先賀，李蒙蒙，等. HPLC-ELSD法測定人參不同部位13種人參皂苷的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2017，34（7）：565-569.

[13] 劉宏群，孫長波，曲正義.近紅外光譜技術(shù)在人參定性、定量和在線檢測分析中的應(yīng)用[J].中國藥房，2018，29（13）：1855-1858.

（收稿日期：2018-08-03 修回日期：2018-10-09）

（編輯：鄒麗娟）