4-AP對(duì)MPTP誘導(dǎo)PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)行為影響

賈璐 石麗敏 謝俊霞

[摘要]?目的?探討A型鉀通道抑制劑4-氨基吡啶（4-AP）對(duì)l-甲基4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的帕金森?。≒D）模型小鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響。

方法8周齡雄性C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組、MPTP組以及4-AP+MPTP組，每組10只。采用連續(xù)5 d腹腔注射MPTP（30 mg·kg-1·d-1）的方法制備PD小鼠模型。4-AP+MPTP組在每天注射MPTP前30 min腹腔注射4-AP（1 mg·kg-1·d-1），對(duì)照組以等量生理鹽水代替MPTP和4-AP。連續(xù)5 d注射后進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

結(jié)果MPTP組小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)頭時(shí)間和爬桿時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，而4-AP+MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時(shí)間和爬桿時(shí)間較MPTP組明顯縮短，差異均有顯著意義（F=32.26、25.53，P<0.01）。

結(jié)論4-AP可使MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力有所改善。

[關(guān)鍵詞]?4-氨基吡啶;l-甲基4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶;帕金森病;運(yùn)動(dòng)障礙

[中圖分類(lèi)號(hào)]?R742.5;R971.8

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]?A

[文章編號(hào)]??2096-5532（2019）01-0044-03

EFFECT OF 4-AP ON MOTOR BEHAVIOR IN MPTP MOUSE MODEL OF PARKINSONS DISEASE

JIA Lu， SHI Limin， XIE Junxia

（Department of Physiology， State Key Disciplines： Physiology， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of 4-aminopyridine （4-AP）， an inhibitor of A-type potassium channel， on motor behavior in mice with Parkinsons disease （PD） induced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）.

MethodsThirty 8-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into MPTP group， 4-AP+MPTP group， and control group， with 10 mice per group. The mice in the MPTP group and 4-AP+MPTP group received intraperitoneal injection of MPTP （30 mg·kg-1·d-1） for 5 consecutive days to establish a mouse model of PD; in addition， the mice in the 4-AP+MPTP group were intraperitoneally injected with 4-AP （1 mg·kg-1·d-1） 30 min before the daily injection of MPTP. As for the control group， MPTP and 4-AP were replaced by an equal volume of normal saline. The pole test was performed after 5 consecutive days of injection.

ResultsThe time to turn around and time to reach the floor in the MPTP group were significantly longer than those in the control group， while they were significantly shortened in the 4-AP+MPTP group compared with the MPTP group （F=32.26 and 25.53，P<0.01）.

ConclusionInhibition of A-type potassium channel by 4-AP may attenuate motor coordination dysfunction in mice with MPTP-induced PD.

[KEY WORDS]4-aminopyridine; 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine; Parkinson disease; motor disorders

帕金森?。≒D）又稱(chēng)震顫麻痹，是常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。其病理特征主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失，紋狀體多巴胺含量減少[1]。PD的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與遺傳、環(huán)境、氧化應(yīng)激、鐵沉積、自身免疫、細(xì)胞凋亡等因素相關(guān)[2-9]。目前使用的1-二羥基苯丙氨酸、多巴胺前體和多巴胺激動(dòng)劑等療法在改善PD運(yùn)動(dòng)損傷方面僅取得了有限的成功。因此，尋找療效可靠、不良反應(yīng)少的PD治療藥物是亟待解決的重要問(wèn)題[10]。近年來(lái)研究表明，PD的發(fā)病可能與鉀離子通道的功能異常相關(guān)，因而PD也被認(rèn)為是一種“離子通道病”[11-15]。以鉀離子通道為靶點(diǎn)的PD治療思路已成為目前該病治療研究領(lǐng)域中的一個(gè)重要的探索方向。A型鉀通道是電壓依賴(lài)性鉀離子通道的重要分支，在控制神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等方面發(fā)揮重要作用[12]。以往研究結(jié)果表明，A型鉀通道特異性阻斷劑4-氨基吡啶（4-AP）能夠增強(qiáng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性[16-17]。本實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)典神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶（MPTP）制備PD小鼠模型，通過(guò)爬桿實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)4-AP對(duì)PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響。

1?材料與方法

1.1?動(dòng)物及分組

[CM（20]SPF級(jí)8周齡雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量（20±2）g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（蘇）2016-0010。小鼠于20 ℃、晝夜循環(huán)光照條件下飼養(yǎng)，可自由攝食、飲水、活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)前讓其適應(yīng)環(huán)境1周。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、MPTP組（B組）和4-AP+MPTP組（C組），每組10只。

1.2?給藥方法

各組小鼠均給予連續(xù)5 d腹腔注射，MPTP組腹腔注射MPTP（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）30 mg·kg-1·d-1，4-AP+MPTP組在每天注射MPTP前30 min腹腔注射4-AP（購(gòu)自英國(guó)TOCRIS公司）1 ?mg·kg-1·d-1，對(duì)照組則以等量生理鹽水代替MPTP和4-AP。

1.3?爬桿實(shí)驗(yàn)

制作一根直徑1 cm、長(zhǎng)50 cm 的桿，在其頂端固定一個(gè)直徑為1.5 cm 小球，頂端小球纏上紗布以增加摩擦力，將桿豎直放置在一個(gè)方形的塑料盆中。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將小鼠頭放置在小球上，記錄小鼠從開(kāi)始運(yùn)動(dòng)到完全轉(zhuǎn)為頭向下的時(shí)間（轉(zhuǎn)頭時(shí)間）和爬桿時(shí)間。每只小鼠進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，取平均值[18]。

1.4?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得計(jì)量數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，多組比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，以Turkey法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)??果

MPTP組小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)頭時(shí)間和爬桿時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，而4-AP+MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時(shí)間和爬桿時(shí)間較MPTP組明顯縮短，差異均有顯著性（F=32.26、25.53，P<0.01）。表明MPTP組小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力嚴(yán)重受損，給予4-AP預(yù)處理則改善了小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。見(jiàn)表1。

3?討??論

A型鉀通道又稱(chēng)為瞬時(shí)外向型鉀通道，是一種電壓依賴(lài)型鉀通道，在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元上廣泛表達(dá)，具有較大的電流幅度（從數(shù)百pA到15 nA左右）。在哺乳類(lèi)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，A型鉀通道主要由Kv4基因家族形成的α亞基以及KChip基因

家族形成的輔助β亞基共同組成，其中Kv4基因家族包括KCND1、KCND2和KCND3，KChip家族包括KChip1、KChip2、KChip3和KChip4[19-21]。

Kv4.3/KChip3.1是A型鉀通道在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元上的主要組成部分[22]。以往研究結(jié)果證實(shí)，A型鉀通道對(duì)動(dòng)作電位的幅度、動(dòng)作電位時(shí)程發(fā)揮著重要的精細(xì)調(diào)節(jié)作用，阻斷該通道則可以明顯提高多巴胺能神經(jīng)元的放電頻率[16-17]。由于紋狀體區(qū)多巴胺的釋放可被黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的電活動(dòng)變化直接影響，A型鉀通道的阻斷劑可以通過(guò)抑制IA提高神經(jīng)元的興奮性，增加多巴胺的含量[23]。因此，4-AP可能通過(guò)調(diào)控中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的電活動(dòng)，改善黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的功能，從而有效緩解PD運(yùn)動(dòng)功能障礙。

本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)5 d腹腔注射MPTP方法制備亞急性PD小鼠模型。MPTP是一種神經(jīng)毒素，極易通過(guò)血-腦脊液屏障，具有強(qiáng)脂溶性。MPTP本身沒(méi)有毒性，進(jìn)入腦內(nèi)后，在線(xiàn)粒體內(nèi)單胺氧化酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镸PP+，隨后，多巴胺能神經(jīng)元通過(guò)細(xì)胞膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體特異性攝取MPP+，細(xì)胞內(nèi)游離的MPP+通過(guò)耗能的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)入線(xiàn)粒體與呼吸鏈的復(fù)合物結(jié)合，阻斷線(xiàn)粒體電子傳遞系統(tǒng)，導(dǎo)致能量代謝障礙和自由基的生成增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。除上述氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體功能損傷等毒性機(jī)制外，近期研究還顯示MPP+可以降低黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性，減少細(xì)胞的自發(fā)放電[25-26]。由于神經(jīng)元興奮性的變化與多巴胺遞質(zhì)的含量以及運(yùn)動(dòng)功能密切相關(guān)，因此本研究首先觀察了MPTP制備的PD小鼠模型運(yùn)動(dòng)行為的變化。本文研究結(jié)果顯示，腹腔注射MPTP使小鼠運(yùn)動(dòng)能力明顯降低，出現(xiàn)與PD病人類(lèi)似的肌張力增高、運(yùn)動(dòng)遲緩等表現(xiàn)，在爬桿實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)頭時(shí)間和爬桿時(shí)間明顯延長(zhǎng)。而給予4-AP預(yù)處理組小鼠的轉(zhuǎn)頭時(shí)間和爬桿時(shí)間較MPTP組明顯縮短，表明4-AP預(yù)處理能明顯改善MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙。推測(cè)其機(jī)制可能是由于4-AP抑制了A型鉀通道，提高了多巴胺能神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而增加了紋狀體多巴胺的含量，使PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙癥狀得到改善。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究鉀離子通道在PD中的作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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