大腸桿菌茶氨酸合成酶基因γ-GGT的生物信息學(xué)分析

呂晶晶 張?zhí)炀?楊仕梅 宋莉 趙德剛

摘 要：γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GGT）是催化L-茶氨酸合成的關(guān)鍵酶之一，對(duì)其編碼基因的解析有助于進(jìn)行茶氨酸的合成調(diào)控和異源表達(dá)生產(chǎn)研究，本論文利用生物信息學(xué)方法，對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）γ-GGT基因的結(jié)構(gòu)和特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，E.coli γ-GGT基因編碼580個(gè)氨基酸，主要氨基酸為甘氨酸和亮氨酸，γ-GGT酶蛋白等電點(diǎn)為5.38，分子量為61.7 kDa，屬于酸性不穩(wěn)定親水性蛋白，具有信號(hào)肽序列和保守功能結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞質(zhì)周質(zhì)中發(fā)揮作用，其二級(jí)結(jié)構(gòu)元件主要是α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，在微生物中進(jìn)化較為保守。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究γ-GGT基因功能及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌;γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶;茶氨酸合成;GGT酶蛋白;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：Q180.99

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）01-0074-05 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.014

茶氨酸（Theanine）是一種不參與蛋白組成的游離氨基酸[1]，于1950 年首次從綠茶中首次分離得到[2]，是一種難以替代的生物活性物質(zhì)，具有廣泛的藥用和保健價(jià)值，如降血壓[3]、提高免疫力[4]、抑制興奮[5]、減輕體重[6]、緩解精神壓力[7，8]、提高學(xué)習(xí)能力和記憶力[7]等。γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，γ-GGT）是茶氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，其通過(guò)將谷氨酰胺上的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移到乙胺受體上催化合成茶氨酸[4]，該反應(yīng)過(guò)程不需要ATP，底物可以是成本低廉的谷氨酰胺和谷胱甘肽等[9]，因此γ-GGT在茶氨酸生產(chǎn)中具有重要價(jià)值。對(duì)γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶編碼基因γ-GGT的認(rèn)識(shí)是其異源表達(dá)生產(chǎn)茶氨酸的基本前提，本文通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）γ-GGT基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育等進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè)，旨在為進(jìn)一步研究該基因及利用其生產(chǎn)茶氨酸奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源

大腸桿菌γ-GGT基因的CDS序列（EG10374）來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）。

1.2 方法

采用ExPASy工具分析GGT蛋白的理化性質(zhì)，使用PSORTB軟件預(yù)測(cè)GGT蛋白的亞細(xì)胞定位[11]，利用在線軟件SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）預(yù)測(cè)分析信號(hào)肽，利用在線分析工具SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa _automat.pl？page=npsa_sopma.?html）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODE （https：// swissmodel.expasy.org/）在線分析工具預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，通過(guò)blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比對(duì)不同物種的GGT蛋白序列結(jié)構(gòu)，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GGT蛋白的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

通過(guò)ExPASy中的ProtParam工具對(duì)E.coli γ-GGT基因編碼的GGT蛋白（gamma-glutamyltrans- peptidase/GGT/EC）進(jìn)行理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明：γ-GGT基因編碼580個(gè)氨基酸，組成氨基酸中以甘氨酸（Gly）最為豐富（占9.7%），其次是亮氨酸（Leu）（占6.7%）。帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為66，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為55，以負(fù)電荷氨基酸為主。E.coli GGT蛋白的其理論等電點(diǎn)pI為5.38，呈酸性。其理論分子量為61.7kDa。不穩(wěn)定系數(shù)為43.42，推測(cè)GGT蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

利用PSORTB軟件對(duì)GGT蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)（表1），E.coli GGT蛋白位于細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、外膜和細(xì)胞外的分值為0，位于周質(zhì)的分值為10，表明GGT蛋白位于細(xì)胞周質(zhì)，該可能性為100%。

2.2 GGT蛋白的信號(hào)肽和疏/親水性特性

信號(hào)肽是引導(dǎo)新生蛋白向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，其與蛋白的分泌特性有關(guān)。結(jié)果顯示，信號(hào)肽酶切位點(diǎn)C-score（C）分值為26;綜合剪切位點(diǎn)Y-score（Y）分值為26;信號(hào)肽位點(diǎn)S-score（S）是分值為17，可見(jiàn)GGT蛋白具有信號(hào)肽序列，且信號(hào)肽位于1-25位氨基酸之間，表明E.coli GGT蛋白是一種分泌蛋白。

通過(guò)ExPasy中的ProtScale工具對(duì)E.coli GGT蛋白進(jìn)行疏水性及親水性的預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示該蛋白的平均親水系數(shù)為-0.220，表明 GGT蛋白是一種親水性蛋白，分布在細(xì)胞膜的可能性不大。

2.3 GGT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與分布

利用SOPMA在線工具分析E.coli GGT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，GGT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由34.14%的α-螺旋（Helix），19.83%的延伸鏈（Sheet），11.03%的β-轉(zhuǎn)角（Turn）和35%的無(wú)規(guī)卷曲（Coil）組成，以Helix和Coil結(jié)構(gòu)為主（表2）。

E.coli GGT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成成分分布圖顯示，各組成單元Helix、Sheet、Turn和Coil均較為平衡地分布于整個(gè)蛋白多肽鏈中。

2.4 GGT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要元件

通過(guò)SWISS-MODEL在線分析工具對(duì)E.coli GGT蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，建立其三維結(jié)構(gòu)模型。該模型顯示出GGT蛋白具有明顯可見(jiàn)的Helix和Coil結(jié)構(gòu)，其空間結(jié)構(gòu)的主要組成元件是α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果是一致的。

2.5 GGT蛋白的功能結(jié)構(gòu)域

利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)E.coli GGT蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果顯示GGT蛋白具有明顯的保守結(jié)構(gòu)域（Pfam登錄號(hào)：PF01019），除了1-25位氨基酸序列構(gòu)成的信號(hào)肽以外，在63-574位氨基酸之間構(gòu)成γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶的功能結(jié)構(gòu)域。在原核和真核生物中，γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶是由兩條多肽鏈（一個(gè)重鏈和一個(gè)輕亞基）組成的酶，其由單鏈前體通過(guò)自動(dòng)催化切割加工而成，小亞基上的N-端氨基酸是嚴(yán)格保守的蘇氨酸殘基，該殘基是自加工和酶反應(yīng)的催化親和位點(diǎn)[12-14]，可以催化谷胱甘肽的γ-谷氨酰基部分轉(zhuǎn)移到氨基酸、多肽或是水等受體上形成谷氨酸，這是GGT在γ-谷氨酰循環(huán)、谷胱甘肽的合成和降解途徑以及藥物和異生毒素解毒中發(fā)揮關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.6 GGT蛋白的進(jìn)化分析

對(duì)大腸桿菌與部分物種的GGT蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以揭示大腸桿菌與其他物種GGT蛋白的親緣關(guān)系。利用MEGA 7.0軟件基于GGT蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Neighbor-Joining，NJ），在Boostrap值為1000的條件下，發(fā)現(xiàn)GGT蛋白進(jìn)化相對(duì)保守，不同物種的GGT主要聚在一個(gè)大類群中，僅小部分單獨(dú)分支。大腸桿菌的GGT蛋白與腸道沙門氏菌亞種腸道血清變型傷寒沙門氏菌（NP_458368.1）同源性最高，其次是天藍(lán)色鏈霉菌 （NP_630494.1），在微生物中表現(xiàn)出較高的親緣關(guān)系;而與新型腹瀉原蟲(chóng) （XP 001827855.1）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，暗示在不同物種間GGT蛋白酶的催化能力可能會(huì)有較大區(qū)別。

3 結(jié)論與討論

γ-GGT基因編碼的γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶在生物體內(nèi)廣泛存在[9]，是谷胱甘肽代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)和特性的解析是利用其進(jìn)行生物反應(yīng)器生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的重要基礎(chǔ)。信號(hào)肽是對(duì)蛋白的分泌起主導(dǎo)作用的位于分泌蛋白N端的一段序列[15-16]，細(xì)菌GGT蛋白為可溶性蛋白，其在自身信號(hào)肽的介導(dǎo)下被轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間發(fā)揮生理作用[17]，細(xì)菌GGT一般位于周質(zhì)[18]和胞外[19]。

本研究表明，大腸桿菌GGT蛋白具有信號(hào)肽序列，是一種不穩(wěn)定的親水性周質(zhì)酶蛋白，這與上述報(bào)道是一致的。由于細(xì)胞周質(zhì)的氧化環(huán)境有利于蛋白的折疊，其產(chǎn)生的蛋白具有活性并易于提取純化[20]，E.coli GGT蛋白超量表達(dá)時(shí)可獲得有效高活性的蛋白，在基因工程生物反應(yīng)器生產(chǎn)中有利于提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量。已有報(bào)道證實(shí)重組大腸桿菌工程菌株可以獲得γ-GGT基因的高效表達(dá)[21]。在生物細(xì)胞中，GGT酶催化谷胱甘肽的γ-谷氨?；糠洲D(zhuǎn)移到氨基酸、多肽或水等受體上形成谷氨酸，也可通過(guò)催化底物谷氨酰胺和乙胺發(fā)生轉(zhuǎn)谷氨?；磻?yīng)生成茶氨酸[22]，在谷胱甘肽的合成和降解、γ-谷氨酰循環(huán)以及藥物和異生毒素解毒等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，該生物學(xué)功能實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是GGT蛋白特定的結(jié)構(gòu)功能域[9]。本研究通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GGT蛋白進(jìn)行搜索發(fā)現(xiàn)其具有保守和典型的功能域結(jié)構(gòu)，這為揭示其催化活性提供了分子依據(jù)。對(duì)哺乳動(dòng)物和細(xì)菌GGT基因的測(cè)序分析表明，GGT基因均編碼580個(gè)氨基酸，編碼蛋白的同源性極高[23-27]，可見(jiàn)，GGT蛋白的進(jìn)化相對(duì)保守，在不同物種間具有一定的通用特性，本研究中不同物種的GGT蛋白主要聚在一個(gè)大類群中予以了證實(shí)，尤其在微生物中最為明顯，這也提示進(jìn)行GGT蛋白的異源表達(dá)生產(chǎn)具有較高的可行性。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 高小紅，袁 華，喻宗沅.?茶氨酸的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2004，21（1）：7-9.

[2] Sakato Y.?The chemical constituents of tea ：III.?A new amide theanine[J]. Nippon Nogeikagaku Kaishi，1949（23）：262-267.

[3] 呂 毅，郭雯飛，倪捷兒，等.?茶氨酸的生理作用及合成[J].茶葉科學(xué)，2003，23（1）：1-5.

[4] 王麗鴛，王賢波，成 浩，等.?基因工程菌生物合成茶氨酸條件研究[J].茶葉科學(xué)，2007，27（2）：111-116.

[5] Yokogoshi H，Kobayashi M.?Hypotensive effect of gamma-glutamylmethylamide in spontaneously hypertensive rats[J].Life Sciences，1998，62（12）：1065-1068.

[6] Kamath AB，Wang L，Das H，et al.?Antigens in tea-beverage prime human Vγ2Vδ2 T cells in vitro and in vivo for memory and nonmemory antibacterial cytokine responses[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100（10）：6009-6014.

[7] Yokogoshi H，Mochizuki M，Saitoh K.?Theanine-induced reduction of brain serotonin concentration in rats[J].Bioscience Biotechnology & Biochemistry，1998，62（4）：816-817.

[8] Kakuda T，Nozawa A，Unno T，et al.?Inhibiting effects of theanine on caffeine stimulation evaluated by EEG in the rat[J].Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan，2000，64（2）：287-293.

[9] 帥玉英.?γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的純化和性質(zhì)及其用于L-茶氨酸的生物制備研究[D].揚(yáng)州：江南大學(xué)，2011.

[10] 王風(fēng)青，梁金鐘，付大偉，等.?γ-PGA降解酶系基因pgdS和ggt的克隆及生物信息分析[J].食品工業(yè)科技，2016，37（16）：190-194.

[11] Suzuki H，Izuka S，Miyakawa N，et al.?Enzymatic production of theanine，an “umami” component of tea，from glutamine and ethylamine with bacterial γ-glutamyltranspeptidase[J].Enzyme & Microbial Technology，2002，31（6）：884-889.

[12] Boanca G，Sand A，Okada T，et al.?Autoprocessing of Helicobacter pylori gamma-glutamyltranspeptidase leads to the formation of a threonine-threonine catalytic dyad[J].Journal of Biological Chemistry，2007，282（1）：534.

[13] Takahashi H，Watanabe H.?Post‐translational processing of Neisseria meningitidisγ‐glutamyl aminopeptidase and its association with inner membrane facing to the cytoplasmic space[J].Fems Microbiology Letters，2004，234（1）：27-35.

[14] 楊運(yùn)桂，徐京寧，胡泰山，等.信號(hào)肽疏水性的提高促進(jìn)青霉素G?；阜置赱J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)（英文），2000（2）：163-168.

[15] Izard J W，Doughty M B，Kendall D A.?Physical and Conformational Properties of Synthetic Idealized Signal Sequences Parallel Their Biological Function[J].Biochemistry，1995，34（31）：9904.

[16] 郭 亮，沈 微，王正祥，等.?生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)茶氨酸的重組大腸桿菌的構(gòu)建[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，24（2）：41-45.

[17] Suzuki H，Kumagai H，Tochikura T.?γ-Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12：Formation and location [J].Journal of ?Bacteriol，1986，168 （3）：1332-1335.

[18] Hiromichi Minami，Hideyuki Suzuki，Hidehiko Kumagai.?Salt-tolerant γ-glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis，168 with glutaminase activity[J].Enzyme & Microbial Technology， 2003，32（3）：431-438.

[19] 郭建華.?蔗糖濃度對(duì)滲透休克法提取細(xì)胞周質(zhì)重組蛋白的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（4）：147-148.

[20] 賈曉鶴，陳 莉，趙寧偉，等.?生物轉(zhuǎn)化法應(yīng)用重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成L-茶氨酸[J].食品工業(yè)科技，2008（2）：166-169.

[21] Suzuki H，Kumagai H.?Autocatalytic Processing of γ-Glutamyltranspeptidase[J].Journal of Biological Chemistry，2002，277（45）：43536-43543.

[22] Ishiye M， Yamashita M， Niwa M.?Molecular cloning of the γ-glutamyltranspeptidase gene from a Pseudomonas strain [J].Biotechnol ogy Progree，1993，9 （3）：323-331.

[23] Suzuki H，Kumagai H.?Gamma-glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12[J].Seikagaku the Journal of Japanese Biochemical Society，1989，61（6）：491-496.

[24] Chevalier C，Thiberge J M，F(xiàn)errero R L，et al.?Essential role of Helicobacter pylori γ-glutamyltranspeptidase for the colonization of the gastric mucosa of mice[J].Molecular Microbiology，2010，31（5）：1359-1372.

[25] Xu K，Strauch MA.?Identification，sequence，and expression of the gene encoding gamma-glutamyltranspeptidase in Bacillus subtilis[J].Journal of Bacteriology，1996，178（14）：4319-4322.

[26] Lin LL，Chou PR，Hua YW，et al.Overexpression，one-step purification，and biochemical characterization of a recombinant γ-glutamyltranspeptidase from Bacillus licheniformis[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2006，73 （1）：103-112.

[27] JeanF.?Tomb，Owen White，Anthony R.?Kerlavage，et al.?The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori[J].Nature，1997，388（6642）：539.